O型口蹄疫病毒抗体高敏荧光免疫分析法.pdf

O型口蹄疫病毒抗体高敏荧光免疫分析法 1 范围 本文件规定了以高敏荧光免疫分析法检测牛、羊、猪血清中的O型口蹄疫病毒抗体的原 理、仪器设备、操作步骤、结果分析。 本文件适用于牛、羊、猪血清中O型口蹄疫病毒抗体水平的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输及规范 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 原理 采用免疫夹心法和高敏荧光免疫分析法相结合技术，检测动物血清样本中的O型口蹄疫 病毒抗体。当血清样本抗体与高敏荧光纳米微球标记的O型口蹄疫病毒重组抗原接触反应后 形成复合物，继续与硝酸纤维素膜上检测线包被的重组O型口蹄疫病毒抗原结合形成“荧光 标记抗原+被测样本抗体+包被抗原”复合物反应，其余物质继续向前层析在C线捕获住“荧光 标记鸡IgY+兔抗鸡IgY ”免疫结合物，最后用高敏荧光分析仪读取检测卡上的荧光信号。 4 仪器、材料与试剂 4.1 仪器 4.1.1 高敏荧光分析仪：能在激发波长为(400±20)nm，检测波长为(615±10)nm条件下检测。 4.1.2 单道可调移液器（10-100μL）和（0.5-10μL）。 4.1.3 分析天平：0.0001g。 4.1.4 离心机。 4.1.5 冰箱。 4.2 材料 4.2.1 O 型口蹄疫阳性血清。 4.2.2 O 型口蹄疫病毒抗体高敏荧光免疫分析法检测试剂卡（图1）：硝酸纤维膜上包被 有灭活的O 型口蹄疫病毒，用于样品中O 型口蹄疫病毒抗体与高敏荧光纳米微球标记O 型 口蹄疫重组抗原反应后，再与硝酸纤维素膜上包被灭活的O 型口蹄疫病毒反应。 1 图1 O型口蹄疫病毒抗体高敏荧光检测试剂卡示意图 4.3 试剂 4.3.1 水：按照GB/T 6682 中的要求，二级。 4.3.2 样品稀释液(见附录A)。 4.3.3 高敏荧光纳米微球：荧光寿命≥400μs 5 样品采集与处理 5.1 样品的采集 应按照NY/T 541-2002 《动物疫病实验室检测采样方法》中的规定进行，并做好安全防 护。按常规方法用干燥、洁净的离心管或适当容器采集3～5mL血液。 5.2 样品的处理 血液样本用离心机3000r/m离心3min，血清量不少于500μL。 5.3 样品的贮存 血清样本在2-8 ℃冷藏可保存24小时，如需长期保存应置-20℃或-80℃。 6 检测方法 6.1 样品稀释 待检血清样本和O 型口蹄疫病毒抗体高敏荧光免疫分析法检测试剂卡从2-8℃取出，平 衡到室温(25℃左右）。 2 用样品稀释液将待测血清样本按1:50稀释。 6.2 加样 从原包装铝箔袋中取出O 型口蹄疫病毒抗体高敏荧光免疫分析法检测试剂卡，置于平 净平坦的台面上，用移液器吸取离心管中事先准备好的已稀释好的检测样本垂直滴加80μL 于加样孔内。 6.3 检测 避光层析 15min后用高敏荧光检测仪检测。 7 结果计算 B—高敏荧光分析仪读取标准溶液或样本溶液的检测卡上的荧光信号T/C值 B —高敏荧光分析仪读取稀释液检测卡上的荧光信号的T/C值 O 以标准品B-B 值的对数为纵坐标，以O型口蹄疫病毒抗体阳性血清效价对数为横坐标， O 绘制标准曲线图。将样本的荧光信号值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的样 本中O型口蹄疫病毒抗体效价。 注：软件自带计算功能，能准确算出当前样本T/C值所对应的O型口蹄疫病毒抗体效价。 8 判定标准 8.1 定量检测抗体效价 效价≥16 （含）时抗体为阳性；8 （含）～16时抗体为可疑，效价<8 时抗体为阴性，抗 体含量与效价成正比。 8.2 抗体保护判定 牛、羊样本抗体保护判定：效价≥128 抗