口蹄疫病毒A型与O二联时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法.pdf

口蹄疫病毒A型与O型二联时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法 1 范围 本文件规定了口蹄疫病毒A型与O型二联时间分辨荧光免疫层析抗体试剂与耗材、技术原理、实验 前准备工作、操作步骤、试验成立条件及结果判定等内容。 本文件适用于检测猪、牛、羊全血或血清中的口蹄疫病毒A型与O型抗体，并可用于口蹄疫病毒A 型与O型抗体的免疫筛查、辅助诊断等。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 时间分辨荧光免疫层析技术 Time Resolved Fluorescence Immunochromatography assay;TRFIA 是以时间分辨荧光微球作为示踪物，将抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析来呈现免疫反 应结果的一种新型免疫分析技术。 4 试剂与耗材 4.1 口蹄疫病毒A型与O型二联时间分辨荧光免疫层析抗体检测卡的制备，按照附录A制备。 4.2 相关试剂的配制，按照附录B制备。 4.3 微量毛细采样管 （10 µL） 4.4 移液枪 （10 µL～100 µL） 4.5 注射器 （5 ml） 4.6 便携式荧光免疫分析仪及ID卡，按照附录C操作。 5 技术原理 采用时间分辨荧光免疫层析技术和双抗原夹心技术原理制成，采用纳米荧光微球作为示踪物，分别 标记口蹄疫A型抗原、口蹄疫O型抗原，并制成荧光微球垫。硝酸纤维素膜上质控线（C线）包被相应 1 抗体，检测线1 （T1线）包被口蹄疫A型抗原，检测线2 （T2线）包被口蹄疫O型抗原。加入样本后，样 本与荧光微球标记物一起沿层析膜移动，若样本中存在口蹄疫A型抗体则与荧光微球标记物及检测线1 上的抗原结合而产生荧光信号值 （T1值）；若样本中存在口蹄疫O型抗体则与荧光微球标记物及检测线 2上的抗原结合而产生荧光信号值 （T2值）；荧光微球标记物继续移动与质控线（C线）上的抗体结合 产生荧光信号值（C值），仪器计算出口蹄疫A型抗体检测值（T1/C值）和口蹄疫O型抗体的检测值（T2/C 值）。 6 实验前准备工作 6.1 样品的采集与处理 按照NY/T 541中的规定进行猪、牛、羊全血或血清样本的采集与处理，并做好个人防护。 6.2 血清样本的存放与运输 按照NY/T 541中的规定进行血清样本的存放与运输。血清样本若在一周内检测，可置2 ℃～8℃条 件下保存。若超过一周检测，应置于-20 ℃以下冷冻保存。运输时注意冷藏，确保样品清亮无污染。采 集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照相关规范进行样品的 生物安全标识。 6.3 全血样本的存放与运输 按照NY/T 541中规定的进行全样本的存放与运输。全血样本若在24h内检测，应置于2 ℃～8℃条 件下保存；若超过24h检测，应置于-20 ℃以下冷冻保存。采集的全血样本可用冰袋或保温桶加冰密封 等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照相关规范进行样品的生物安全标识。 7 操作步骤 7.1 取检测卡 将口蹄疫病毒A型与O型二联时间分辨荧光免疫层析抗体检测卡放于平整、洁净的台面上，恢复至 室温。 7.2 样品稀释 用微量毛细采样管取10μL全血或血清样本按照1:10比例，加入到已备好的样本稀释液中混匀，稀 释后的样品应在1h内完成检测。 7.3 加样及孵育 用移液枪吸取稀释好的样本100μL，加入到加样孔内，室温下静置反应15min。 7.4 仪器检测读数 读数前先将产品配套ID卡插入便携式荧光免疫分析仪，之后将完成反应的检测卡加样孔朝里插入 便携式荧光免疫分析仪，点击 “快速检测”进行读值。超过25min的检测结果无效。 8 试验成立条件 2 当仪器完成读值后，如果“检测值”项显示“无效”，说明仪器未检测到荧光信号，则实验不成立， 需重新检测。 如果 “检测值”项显示数值，说明质控线和检测