非洲猪瘟病毒时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法.pdf

非洲猪瘟病毒时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒时间分辨荧光免疫层析抗体检测方法的范围、规范性引用文 件、术语和定义、符号与缩略语、试剂与耗材、器材与设备、技术原理、操作步骤、结果判 定等内容。 本文件适用于检测猪全血或血清中的非洲猪瘟病毒抗体，用于非洲猪瘟病毒抗体的免疫 筛查和辅助诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 NY/T541-2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 时间分辨荧光免疫层析技术 TimeResolvedFluorescenceImmunochromatography assay （TRFIA），是以时间分辨荧光微球作为示踪物，将抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜 上，通过层析来呈现免疫反应结果的一种新型免疫分析技术。 4 试剂及耗材 4.1 非洲猪瘟病毒时间分辨荧光免疫层析抗体检测卡的制备，按照附录A 制备。 4.2 相关试剂的配制，按照附录B 制备。 4.3 便携式免疫荧光分析仪及配套 ID 卡，能在荧光检测波段 365/610nm 条件下检测，按照 附录C 操作。 4.4 微量毛细采样管（10µL）。 4.5 移液枪（10µL～100µL）。 4.6 注射器（5ml） 5 检测原理 采用时间分辨荧光免疫层析技术和双抗原夹心技术原理制成，采用纳米荧光微球作为示 踪物，标记非洲猪瘟抗原制成荧光微球垫，硝酸纤维质控线（C线）包被相应抗体，检测线 2 包被非洲猪瘟抗体。加入样本后，样本与荧光微球标记物一起沿层析膜移动，若样本中存在 非洲猪瘟抗体则与荧光微球标记物及检测线上的抗原结合而产生荧光信号值（T值），荧光 微球标记物继续移动与质控线（C线）上的抗体结合产品荧光信号值（C值），仪器计算出 T/C，即非洲猪瘟病毒抗体的检测值。 6 实验前准备工作 6.1 样品的采集与处理 按照NY/T541中的规定进行猪全血或血清样本的采集与处理，并做好个人防护。 6.2 血清样本的存放与运输 按照NY/T541中的规定进行血清样本的存放与运输。血清样本若在一周内检测，可置 2℃～8℃条件下保存。若超过一周检测，应置于-20 ℃以下冷冻保存。运输时注意冷藏， 确保样品清亮无污染。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应 尽量缩短。按照相关规范进行样品的生物安全标识。 6.3 全血样本的存放与运输 按照NY/T541中规定的进行全样本的存放与运输。全血样本若在24h内检测，应置于 2℃～8℃条件下保存；若超过24h检测，应置于-20℃以下冷冻保存。采集的全血样本可用 冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照相关规范进行样品的生物安 全标识。 7 操作步骤 7.1 取检测卡 将非洲猪瘟病毒时间分辨荧光免疫层析抗体检测卡放于平整、洁净的台面上，恢复至室 温。 7.2 样品稀释 用微量毛细采样管取10μL全血或血清样本按照1 ∶10比例，加入到已备好的样本稀释液 中混匀，稀释后的样品应在1h内完成检测。 7.3 加样及孵育 用移液枪吸取稀释好的样本，加入100μL到加样孔内，室温下静置反应15min。 7.4 仪器检测读数 读数前先将产品配套ID卡插入便携式荧光免疫分析仪，之后将完成反应的检测卡加样 孔朝里插入便携式荧光免疫分析仪，点击“快速检测”进行读数。反应总时间超过25min的读 值检测结果无效。 8 试验成立条件 3 当仪器完成读值后，如果“检测值”项显示“无效”，说明质控线或检测线荧光信号值 不正常，则实验不成立，需重新检测。 如果“检测值”项显示数值，说明质控线和检测线荧光信号值正常，则实验成立。 9 结果判定 当非洲猪瘟病毒抗体检测值＜0.1时，判为非洲猪瘟病毒抗体阴性。 当非洲猪瘟病毒抗体检测值≥0.1时，判为非洲猪瘟病毒抗体阳性。