非洲猪瘟病毒纳米抗体夹心ELISA检测方法.pdf

非洲猪瘟病毒纳米抗体夹心ELISA 检测方法 1 范围 本文件规定了猪血液和组织样本中非洲猪瘟病毒纳米抗体夹心ELISA检测抗原的方法，包括试剂与 材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。 本文件适用于猪血液和组织样本中非洲猪瘟病毒抗原的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T18648 非洲猪瘟诊断技术 GB19489 实验室生物安全通用要求 GB/T33087 仪器分析用高纯水规格及试验方法 NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 ASF：非洲猪瘟（AfricanSwineFever） ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus） ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay） BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin） PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline） SDAL：抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAL （NanobodySDALagainstASFVp30protein） SDAZ：抗ASFVp30蛋白纳米抗体SDAZ （NanobodySDAZagainstASFVp30protein） HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase） 5 试剂 5.1 抗ASFVp30 蛋白纳米抗体SDAL，见附录A 2 5.2 抗ASFVp30 蛋白纳米抗体SDAZ，见附录B 5.3 HRP 标记抗ASFVp30 蛋白纳米抗体SDAZ，见附录C 5.4 阳性对照，见附录D1 5.5 阴性对照，见附录D2 5.6 包被缓冲液，见附录E1 5.7 封闭液，见附录E2 5.8 稀释液，见附录E3 5.9 25×浓缩洗涤液，见附录E4 5.10 TMB底物溶液 5.11 终止液，见附录E5 6 试验原理 本文件采用双抗体夹心ELISA反应原理，酶标板上包被抗ASFVp30蛋白的纳米抗体SDAL，捕获待 检样本中的ASFV抗原，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗ASFVp30蛋白的纳米抗体SDAZ进行孵 育。当样本中存在ASFV抗原，形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物，酶标抗体SDAZ上连接的HRP催 化显色反应；当样本中无ASFV抗原，则不能被纳米抗体SDAL捕获，也不能与酶标抗体SDAZ结合，加 入底物后不显色；根据样品检测的吸光度，可以定性判定样本中是否有非洲猪瘟病毒抗原。 7 仪器设备及耗材 7.1 分析天平（精确度：0.0001g） 7.2 37 ℃温箱 7.3 2 ℃~8 ℃冰箱，-20 ℃冰箱 7.4 离心机 7.5 单道微量移液器（0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1mL） 7.6 多道移液器（300μL） 7.7 1.5mL尖底离心管 7.8 酶标测定仪 7.9 酶标板 7.10 封板膜 7.11 BSL-II 级生物安全柜 3 8 操作步骤 8.1 样品采集、运输与保存 样品采集按照NY/T541进行。无菌注射器静脉采集猪全血，不少于5mL，若在1周内检测，可置 2 ℃～8 ℃条件下保存，若超过1周检测，应置于-20 ℃以下冷冻保存。采集猪的脾脏、淋巴结、肝脏 和肾脏组织样本，组织样本应在48h以内检测，若超过48h，应置于-20 ℃以下冷冻保存，且避免反复 冻融。 全血和组织样本运输时注意冷藏，确保样品有效。按照《兽医实验室生物安全要求通则》进行样品 的生物安全标识。 8.2 样品处理 8.2.1 血液样品