狂犬病抗体高敏荧光免疫分析法.pdf

狂犬病病毒抗体荧光免疫层析检测法 1 范围 本文件规定了狂犬病病毒抗体荧光免疫层析检测法的原理、仪器设备、操作步骤、结果 分析。 本文件适用于犬、猫、狼的狂犬病病毒抗体水平的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输及技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荧光免疫层析检测法TheFluorescenceImmunochromatographyAssay ；FICA 是以镧系荧光纳米微球作为示踪物，标记抗原或抗体与待测物进行免疫反应，经荧光免 疫分析仪测定最终产物的荧光强度，从而得出待测物浓度的检测方法。 4 原理 采用免疫夹心法和荧光免疫分析法相结合技术，检测动物血清样本中的狂犬病抗体。试 样中狂犬病毒N蛋白抗体与标记高敏荧光微球抗原形成免疫复合物，随样液流至检测线，被 包被抗原捕获形成双抗原夹心免疫结合物。该结合物的量与试样中狂犬病毒N蛋白抗体正相 关，通过高敏荧光分析仪测定荧光强度，实现快速测定狂犬病毒N蛋白抗体含量。 5仪器、材料与试剂 5.1仪器 5.1.1 高敏荧光分析仪：能在激发波长为380nm~420nm，检测波长为605nm~625nm 条件 下检测 1 5.1.2 单道可调移液器（20μL~200μL） 5.1.3 分析天平：感量万分之一（0.0001g） 5.1.4 普通离心机 5.1.5 冰箱 5.2 材料 5.2.1 狂犬病病毒抗体阳性、阴性血清，有兽用诊断检测试剂生产资质企业生产的合格产品。 5.2.2 狂犬病病毒抗体荧光免疫层析检测法试剂卡（图 1）：硝酸纤维膜上包被有狂犬病病 毒N 蛋白抗原（具体浓度和含量根据原材料的情况进行梯度试验确定），用于与样品中狂 犬病病毒N 蛋白抗体结合。 图1 狂犬病病毒抗体荧光免疫层析检测法试剂卡示意图 5.3 试剂 5.3.1 水：按照GB/T6682 中的要求，二级 5.3.2 样品稀释液，按照附录A 的要求配置 5.3.3 高敏荧光纳米微球：荧光寿命≥400μs 6 样品采集与处理 6.1 样品的采集 应按照NY/T541 中的规定进行，并做好安全防护。按常规方法采集3mL~5mL 血液。 6.2 样品的处理 血液样本用离心机3000rpm/min离心3min，血清量不少于100μL~500μL。 6.3 样品的贮存 血清样本在2℃~8℃冷藏可保存24h，如需长期保存应置-20℃或-80℃。 应按照GB19489做好生物安全工作。 7 检测方法 2 7.1 样品稀释 待检血清样本和狂犬病病毒抗体荧光免疫层析检测法试剂卡从2℃~8℃取出，平衡到 室温(25℃左右）。用样品稀释液将待测血清样本按1:10稀释。 7.2 加样 从原包装铝箔袋中取出狂犬病病毒病抗体层析检测法试剂卡，置于平净平坦的台面上， 用移液器吸取离心管中事先准备好的已稀释好的检测样本垂直滴加80μL于加样孔内。 7.3 检测 避光常温层析 15min后用荧光分析仪检测。 8 结果计算 B—高敏荧光分析仪读取标准溶液或样本溶液的检测卡上的荧光信号T/C值 B —高敏荧光分析仪读取稀释液检测卡上的荧光信号的T/C值 O 以标准品B-B 值的对数为纵坐标，以狂犬病病毒抗体阳性血清效价对数为横坐标，绘 O 制标准曲线图。将样本的荧光信号值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的样本 中狂犬病病毒抗体效价。 注：软件自带计算功能，能准确算出当前样本T/C 值所对应的狂犬病病毒抗体效价。 9 判定标准 检测狂犬病毒 N 蛋白抗体的线性范围 0.2～15IU/mL。 检测结果判定：