鉴别小反刍兽疫免疫与感染的多肽-蛋白芯片抗体检测方法.pdf

鉴别小反刍兽疫免疫与感染的多肽-蛋白芯片抗体检测方法 1 范围 本文件规定了鉴别小反刍兽疫免疫与感染的多肽-蛋白芯片抗体检测方法的技术要求。 本文件适用于检测绵羊/山羊血清中小反刍兽疫病毒抗体，也可用于鉴别小反刍兽疫免疫与感染。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489 实验室生物安全通用要求。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB/T27982-2011小反刍兽疫诊断技术 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义适。 4 缩略语 以下缩略语适用于本文件。 PPRV：小反刍兽疫病毒（Peste desPetitsRuminants Virus） E：抗原表位（Epitope） P：蛋白（Protein） R：比值（Ratio） D：数字化值（Digitalvalue） 5 技术原理 PPRV减毒活疫苗免疫后诱导产生的抗体（IgG）从血清动力学角度可以分为两类，第一类是抗构象 表位的抗体，可以持续且稳定地存在一年以上；另一类是抗线性表位的抗体，其在免疫后1周左右生成， 3周左右达到峰值，60天左右消失。 因此，完整的构象蛋白作为抗原，可以负责检测长期存在的抗体，抗原表位肽可以检测短期存在的 抗体。在免疫时间已知的前提下，如果免疫60天以后，抗原表位肽检测到的抗体呈阳性，提示有野毒感 染。 6 试剂 1 6.1 PPRV抗原表位多肽(E1、E2、E3、E4)，见附录A.1。 6.2 PPRV抗原蛋白（P1、P2），见附录A.2。 6.3 PPR标准阳性血清， 见附录A.3。 6.4 PPR标准阴性血清，见附录A.4。 6.5 EDC 活 化 剂 ： 1-(3- 二 甲 氨 基 丙 基 )-3- 乙 基 碳 二 亚 胺 盐 酸 盐 （1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride），商品化试剂； 6.6 NHS活化剂：N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide），商品化试剂 6.7 酶标试剂：商品化的辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）标记的抗羊IgG抗体，工 作浓度参照产品说明书。 6.8 点样缓冲液：见附录B中的B.1 6.9 1ⅹ洗涤液：见附录B中的B.2 6.10 血清稀释液：见附录B中的B.3 6.11 TMB显色液：商品化试剂，沉淀型。 7 器材与设备 7.1 点样仪。 7.2 恒温孵育仪。 7.3 显色成像仪。 7.4 各种规格的微量移液器（2μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）及吸头。 7.5 一次性注射器（5mL～10mL） 7.6 “0+X”纳米膜 8 血清样本的采集与处理 血清样本的采集与处理，按照GB/T27982-2011 9 操作步骤 9.1 点样 9.1.1 膜的活化：2% EDC（w/v）和1.21% NHS（w/v）置于超纯水中，充分溶解，配制活化液，将膜 置于活化槽中，正面朝上，均匀倒入15ml/块活化液，使膜表面完全侵入，浸泡活化30min。活化结束 后，用超纯水淋洗膜3遍，吹干备用。 9.1.2 点样溶液的配制：制定点样阵列方案（图1），制作分配映射表。用2种蛋白、4种抗原表位多 肽以及羊多克隆抗体（羊IgG）分别配制点样溶液，蛋白和多肽的点样浓度均为0.1mg/ml，羊IgG的点 样浓度为0.05mg/ml，根据分配映射表分配点样溶液到384孔板。 2 图1 芯片阵列 9.1.3 点样：将384孔板和膜放置于点样仪的相应位置。加载点样程序，设置参数，点击程序开始点 样。点样结束后，室温静置过夜。 9.1.4 装配：将检查合格的芯片（无缺点，无拖尾）放于相应的底座上，对准位置安装上盖，确保每 个孔的点在孔中。将芯片置于铝箔袋中，放入一包干燥剂，抽