非洲猪瘟病毒抗体化学发光免疫分析检测方法.pdf

非洲猪瘟病毒抗体化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒抗体化学发光免疫分析检测方法，包括试剂与材料、仪器设备、操作 步骤和结果判定。 本文件适用于猪血清样本中非洲猪瘟病毒抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T18648 非洲猪瘟诊断技术 GB19489 实验室生物安全通用要求 GB/T33087 仪器分析用高纯水规格及试验方法 NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 ASF：非洲猪瘟（AfricanSwineFever） ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus） CLIA：化学发光免疫分析（Chemiluminescenceimmunoassay） BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin） PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline） NBSJ：抗ASFVp72蛋白纳米抗体NBSJ （NanobodyNBSJagainstASFVp72protein） HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase） 5 试剂 5.1 ASFVp72抗原，见附录A 2 5.2 抗ASFVp72 蛋白抗体NBSJ，见附录B 5.3 HRP标记抗ASFVp72 蛋白抗体NBSJ，见附录C 5.4 阳性对照，见附录D1 5.5 阴性对照，见附录D2 5.6 包被缓冲液，见附录E1 5.7 封闭液，见附录E2 5.8 稀释液，见附录E3 5.9 25×浓缩洗涤液，见附录E4 5.10 化学发光底物 6 试验原理 在酶标板上包被ASFVp72抗原，采用竞争原理，加入待检血清孵育，加入辣根过氧化物酶（HRP） 标记的抗ASFVp72蛋白的抗体NBSJ孵育。当待检血清样本中存在ASFV抗体，则阻断了酶标记抗体 NBSJ与酶标板中抗原的结合，加入底物后不显色；当待检样本中无ASFV抗体，酶标记抗体NBSJ能够 与酶标板上的抗原结合，加入底物后，HRP催化底物显色；根据读取样品的化学发光值，可以定性判 定样本中是否有非洲猪瘟病毒抗体。 7 仪器设备及耗材 7.1 分析天平（精确度：0.0001g） 7.2 37 ℃温箱 7.3 2 ℃~8 ℃冰箱，-20 ℃冰箱 7.4 离心机 7.5 单道微量移液器（0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1mL） 7.6 多道移液器（300μL） 7.7 1.5mL尖底离心管 7.8 化学发光免疫分析仪 7.9 化学发光板 7.10 封板膜 8 操作步骤 3 8.1 样品采集、运输与保存 样品采集按照NY/T541进行。无菌注射器静脉采集猪全血，不少于5mL，用自然凝固法分离血清 并置于无菌血清管中。若在1周内检测，可置2～8 ℃条件下保存，若超过1周检测，应置于-20 ℃以下 冷冻保存。 血清样本运输时注意冷藏，确保样品有效。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品 的生物安全标识。 8.2 检测操作步骤 8.2.1 配置洗涤液 将25×浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至工作浓度备用。 8.2.2 包被 用包被缓冲液将ASFVp72抗原稀释至2μg/mL，加入化学发光反应板，100μL/孔，置于4 ℃条件 下孵育过夜（~12h）。 8.2.3 洗涤 弃去液体，每孔加300μL洗涤液洗板3次，每次吸干残液，置于吸水纸上拍干。 8.2.4 封闭 每孔加200μL封闭液，置37 ℃条件下孵育1h；洗涤1次后，置于吸水纸上拍干。 8.2.5 加待检样本和对