非洲猪瘟病毒LAMP目视检测方法.pdf

非洲猪瘟病毒LAMP目视检测方法 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒LAMP 目视检测方法的试剂与耗材、仪器设备、操作步骤、结果判定。 本文件适用于猪全血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓、拭子等样品中非洲猪瘟病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASFV： 非洲猪瘟病毒（AfricanAwineFeverVirus） LAMP： 环介导等温扩增技术（Loop-mediatedIsothermalAmplification） DNA： 脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleicacid） PCR： 聚合酶链式反应（ PolymeraseChainReaction） 5 原理 LAMP 目视法的原理是针对目标DNA 链上的六个区段设计四个不同的引物，再加入一条环引物， 利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需把基因模板、引物、链置换型DNA 合成酶、基质 等共同置于一定温度下（60～65℃）、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15min～1h 内实 9 10 现10 ～10 倍的扩增，有着高度的特异性。通过钙黄绿素可视化方法进行结果观察，只需根据扩增反 应产物的颜色变化来判断是否含有靶基因序列。本文件应用LAMP 目视原理，针对非洲猪瘟病毒VP72 基因设计合成特异性内引物、外引物和环引物，在Bst2.0DNA 聚合酶的作用下63℃反应55min，并 借助钙黄绿素的作用，肉眼观察反应液的颜色变化来判定结果，实现目视判读试验结果。 1 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 引物 采用针对非洲猪瘟病毒VP72 基因（核苷酸序列见附录A）的引物，序列如下表1： 表1 引物序列表 名称 序列 内引物FIP 5’-AGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTAAACATTTCCGTAACTGCTCA-3’ 内引物BIP 5’-ACGGAGGCAATGCGATTAAAATATTCCTCCCGTGGCTTC-3’ 外引物F3 5’-CGTATCCGATCACATTACCT-3’ 外引物B3 5’-ATATGACCACTGGGTTGG-3’ 环引物LB 5’-CCGATGATCCGGGTGCGAT-3’ 6.1.2 ASFVLAMP 目视反应液 ASFVLAMP 目视反应液的配制，见附录B.1。 6.1.3 阳性及阴性对照 阳性及阴性对照的制备见附录C。 6.1.4 其他试剂 病毒DNA提取试剂盒、Bst2.0DNA聚合酶、荧光染料采用商品化产品。 6.2 耗材 6.2.1 离心管：15mL、1.5mL。 6.2.2 0.2mL PCR 反应管。 6.2.3 移液器吸头：10μL、200μL、1000μL。 7 仪器设备 7.1 高速台式冷冻离心机。 7.2 冰箱（2～8℃和-20℃以下）。 7.3 金属浴（25～100℃）或等效控温设备。 7.4 微量移液器（量程：0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL 和200μL～1000μL）。 7.5 二级生物安全柜。 7.6 组织匀浆器。 2 7.7 迷你高速离心机。 7.8 数码相机（选配） 8 操作步骤 8.1 样品采集及运输 样品采集及运输按照NY/T541 的规定执行。采集猪的脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等组织 或全血用于检测，样