丙烯酰胺染毒对小鼠睾丸组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3与角蛋白8表达的影响.docxVIP

丙烯酰胺染毒对小鼠睾丸组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3与角蛋白8表达的影响 丙烯酸（a）广泛应用于各种工业技术领域。2002年4月,瑞典国家食品管理局和Stockholm大学研究人员首先报道,在油炸和烧烤的淀粉类食品(如面包等)检出丙烯酰胺,之后美国等国家也相继报道了类似结果。2006年,Carere提出丙烯酰胺存在于烟草产生的烟雾中,香烟中含有一定量的丙烯酰胺单体。哺乳动物细胞体外培养和体内试验均表明,丙烯酰胺可能具有遗传毒性、神经毒性、生殖毒性、胚胎发育毒性。目前,关于丙烯酰胺生殖毒性的研究备受人们关注。陈昭华认为,丙烯酰胺可能通过诱导细胞凋亡而发挥毒性作用。细胞骨架的改变在细胞凋亡过程中具有重要作用,是细胞凋亡形态学改变的基础。因此,睾丸细胞骨架的损伤可能是导致生殖细胞凋亡的一个重要因素。角蛋白8(cytokeratin 8,CK8)是细胞骨架中间纤维蛋白,正常情况下在睾丸组织中表达。本研究建立丙烯酰胺急性染毒小鼠模型,通过免疫组织化学方法测定细胞凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)和CK8在小鼠睾丸组织表达的变化,为探讨丙烯酰胺的生殖毒性机制提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 hh-2型加热水浴锅 YD-202A型切片机(金华市益迪医疗设备厂),BH-2型光学显微镜(日本Olympus公司),HH-2型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司),数码相机(日本Nikon公司)。 caspase-3兔抗鼠多克隆抗体和CK8兔抗鼠多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司),免疫组化(DAB)染色试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司),苏木素(上海润捷化学试剂有限公司)。 1.2 动物的饲养与饲养 选择健康5~6周龄清洁级雄性昆明小鼠40只,体重为25~30 g,由山西医科大学实验动物中心提供,动物合格证号为SCXK2009-001。动物室室温为(22±2)℃,相对湿度40%~70%,昼夜自然交替,自由饮水和进食。 将实验动物随机分为4组,分别为对照(蒸馏水)组和低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量丙烯酰胺染毒组,每组10只。采用腹腔注射方法进行染毒,染毒容量为0.01 ml/g,连续染毒7 d。每天测量并记录小鼠体重。 1.3 双侧睾丸切片 染毒结束后,称量体重,颈椎脱臼处死小鼠,取双侧睾丸,称重,计算睾丸系数(睾丸系数=睾丸重量/体重×100%)。 将双侧睾丸以10%中性甲醛液固定,经梯度脱水,透明和石蜡包埋,制成4μm切片,60℃烤箱过夜,脱蜡至水。取左侧睾丸标本切片,哈瑞苏木素液染色,1%乙醇盐酸分色,淡氨水返蓝,伊红染色,脱水、透明、封片,光学显微镜组织病理检查。 1.4 caspase-3和ck8蛋白表达 取右侧睾丸标本切片,进行免疫组化检测,操作步骤按试剂盒说明进行。胞浆呈棕黄色细胞为caspase-3蛋白和CK8蛋白表达阳性细胞。采用IPP 6.0图像分析系统进行分析,随机从每张切片左上、左下、右上、右下和中部采集5个区域计算每个视野阳性表达的积分光密度(IOD)值。 1.5 方差齐性检验和单因素方差分析 采用实验数据均以x±s表示。采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)。进一步进行组间两两比较时,若方差齐时,采用SNK检验;若方差不齐时,采用Dunnett’T3检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 统计学处理 表1可见,在第3天前,各组小鼠增重间比较,差异无统计学意义;第7天,中(20 mg/kg)、高剂量(40 mg/kg)丙烯酰胺染毒组体重低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。 2.2 丙烯酰胺染毒对小鼠睾丸重量和血清系数的影响 表2可见,与对照组比较,中(20 mg/kg)、高剂量(40 mg/kg)丙烯酰胺染毒组小鼠睾丸重量明显下降,而仅高剂量丙烯酰胺染毒组睾丸系数明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着丙烯酰胺染毒浓度的升高,小鼠睾丸重量及其脏器系数均呈下降趋势。 2.3 丙烯酰胺染毒对小鼠睾丸曲细精管排列的影响 对照组小鼠睾丸生精小管管腔规则,各阶段生精细胞分界明显,从基部到管腔中央依次为精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子;支持细胞位于生精细胞之间,间质细胞位于生精小管之间,排列规则(封三图1A);低剂量丙烯酰胺染毒组小鼠睾丸曲细精管排列基本规则,各级生精细胞未见明显改变(封三图1B);中剂量丙烯酰胺染毒组小鼠曲细精管排列不规则,生精上皮层次减少(封三图1C);高剂量丙烯酰胺染毒组小鼠睾丸生精小管管腔发生变形,各阶段生精细胞排列紊乱,生成减少,管腔内成熟精子减少(封三图1D)。 2.4 丙烯酰胺染毒小鼠睾丸中caspase