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cd4、cd8、cd20、cd68及mhc-在强直性脊柱炎竖脊肌中的表达 强直性脊柱炎（as）是一种以轴关节慢性炎症为主的结构疾病。在中国，发病率为0.3%，致残率为43.4%。大约10%的患者出现严重障碍，严重影响了他们的生活质量。由于AS以骶髂关节炎症为早期表现,长期以来人们仅关注于AS患者骶髂关节及脊柱方面的研究,而忽略了该病椎旁肌的改变。然而,临床医生在检查患者时,常发现早期的AS患者有椎旁肌失去弹性、变硬、僵直等变化。国外学者研究发现:AS的肌纤维中存在轻度单核细胞及脂肪浸润等病理改变,但他们均未涉及该病的肌肉免疫组织化学研究。在国内还未见到对AS患者椎旁肌病理的相关文献报道。为此,本研究通过对AS患者竖脊肌进行常规HE和各种炎性标记物(CD4、CD8、CD20、CD68及MHC-Ⅰ)的免疫组化染色,来探讨CD4、CD8、CD20、CD68及MHC-Ⅰ在AS(AS组)患者竖脊肌中的表达情况,以及AS竖脊肌中是否存在炎性改变。 1 材料和方法 1.1 性别、年龄及体外诊断 选取2010年10月至2011年9月在南方医科大学南方医院、中西医结合医院及广州市正骨医院门诊和住院的不同疾病患者30例。其中AS 10例,男8例,女2例,年龄20~28岁;多发性肌炎(PM,PM组)10例,男3例,女7例,年龄42~50岁;腰椎间盘突出症(LIDP,LIDP组)10例,男7例,女3例,年龄51~60岁。前2组均符合AS和PM的诊断标准;LIDP组均以CT、MRI检查诊断为LIDP者,并签署肌肉活检同意书。AS组患者行腰部竖脊肌进行活检,PM组患者行肱二头肌进行活检,LIDP组患者在手术中取腰部竖脊肌进行活检。 1.2 pcr检测兔抗人多克隆抗体mhc- 鼠抗人单克隆抗体CD4、CD8、CD20和CD68均购自北京中杉金桥生物技术有限公司,ABC复合物、DAB浓缩液(浓度为1∶20)为该公司统一试剂盒;兔抗人多克隆抗体MHC-Ⅰ购自上海雅吉生物科技有限公司,浓度为1∶500。冰冻切片机(Germany,Leica CM1850-1-1型);标本贮存低温冰箱(USA ULT1786-4-V41型);摄影显微镜(NIKON PHASE CONTRAST,北京中仪光科科技发展有限公司)。 1.3 抗cd4、cd8、cd20、cd65、mhc- 将各组肌肉标本行冰冻切片,每例标本取1张切片行常规HE染色;5张行ABC法免疫组化染色,其处理方法是:冰丙酮固定5 min,晾干后经4%H2O2灭活内源性过氧化物酶15 min,正常山羊血清封闭30 min后弃去血清,分别加入一抗CD4、CD8、CD20、CD68、MHC-Ⅰ,再放入4℃冰箱过夜。PBS液洗涤5 min,滴加适量生物素化二抗工作液,常温孵育30 min,PBS洗涤5 min;滴加ABC复合物30 min,最后DAB显色、苏木精复染、封固。以LIDP组作为阴性对照组,以PM组作为阳性对照组。2位病理专家观察所有染色切片,然后用图像分析软件和数据处理软件进行比较。 1.4 阳性表达强度检测 利用摄影显微镜,并固定光线强度,在每张免疫组化切片上随机选取10个观察视野,以10×20倍摄像,出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。CD4、CD8、MHC-Ⅰ阳性表达均位于细胞膜和炎性细胞表面,而CD68阳性表达则位于细胞浆中;阴性表达强度以LIDP组作标准。将每张切片的10个视野图像运用Imagepro-plus 6.0图像分析软件处理:分别测量阳性表达区的Area(总面积)、Mean Density(平均吸光度值),得到IOD值(总面积×平均吸光度值),因IOD指标包含Density信息,故选取IOD值作为监测指标代表阳性表达强度。然后计算每张切片的IOD值,最后综合10张切片IOD结果,得出每种疾病对各抗体的IOD值。 1.5 cd8方差齐性检验 数据运用SPSS 13.0软件进行统计学处理,计量资料用表示,对各组IOD值经正态性检验:除CD8方差齐性,其余均不符合正态性分布。故利用非参数检验-2 Independent-Samples Test,对AS和PM 2组中CD4、CD8、CD68和MHC-Ⅰ的IOD值(阳性表达强度)进行比较,以双侧P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.13 cd8、mhc-的iiid值与lidp、pm组比较 3组中CD20均未见细胞着色(阴性),故对CD20染色不进行比较分析。AS组CD4、CD8、MHC-Ⅰ的IOD值与LIDP组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);AS组CD8、MHC-Ⅰ的IOD与PM组比较差异均无统计学意义(均P>0.05);PM组CD4、CD68的IOD均明显高于AS组(均P<0.05)。见表1。 2.2 as对血管周围蛋白表达