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（优选）病毒转基因技术原理腺相关病毒 当前1页，总共41页。 第一部分 生物学特性 血清型 病毒结构 病毒复制 对理化因素的抵抗力 当前2页，总共41页。 血清型 AAV是从腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。 共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。 通过签名PCR（signature PCR）技术，利用高度保守序列扩增Cap基因的一小段可变区的DNA序列，以筛检是否是新的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或（和）Rep基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官，发现了大量的具有多样性的AAV的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分型，通称为变株。 AAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与AAV-2型较为类似，不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异。50 ~ 80% AAV-2抗体在人群中检测出。 当前3页，总共41页。 转导不同组织器官的AAV最优血清型 组织 最优血清型 肝脏 AAV-8,AAV-9 骨骼肌 AAV-1,AAV-7,AAV-6, AAV-8,AAV-9 中枢神经系统 AAV-5, AAV-1,AAV-4 肺脏 AAV-9 心脏 AAV-8 肾脏 AAV-2 胰腺 AAV-8 眼睛（光受体细胞） AAV-5, AAV-4 不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极性（tissue tropisms） 当前4页，总共41页。 病毒结构 AAV-2 20–30 nm，基因组为线性、单链的DNA分子。正链和负链的单链DNA分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长4679个核苷酸。 基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为p5、p19和p40启动子），以及两末端为145个核苷酸的反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR） 当前5页，总共41页。 ITR ITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称为D序列（D sequence）。 ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和 RBEˊ ， 以及一个末端解离位点TRS（terminal resolution site）等重要序列。 ITR是在AAV生物学中重要的顺式（cis）作用活性元件，在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。 ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。 当前6页，总共41页。 左端的ORF（Rep基因） 可编码四个Rep蛋白，即Rep78， Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。较大的Rep蛋白如Rep78和 Rep68，由P5启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特异的核酸内切酶活性（切割点在TRS附近）以及位点特异的DNA结合活性（结合于RBE）。因此它们是重要的调节蛋白，以反式（trans）方式参与调节AAV复制周期的所有阶段，如 DNA复制、位点特异性整合、整合病毒基因组的拯救，调节病毒和细胞内基因表达的启动子等。 较小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，参与单链DNA的聚集并包装入病毒体的衣壳。 当前7页，总共41页。 右端的ORF（Cap基因） 由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白，即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。 构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。 当前8页，总共41页。 病毒复制 八个主要步骤： 与细胞表面受体黏附或结合 内吞（endocytosis） 在细胞内经内吞体运输 释放出内吞体 进入胞核 脱壳并释放病毒基因组 启动双链DNA的合成 整合到细胞染色体或以附加子形式持久表达病毒基因 当前9页，总共41页。 不同血清型的AAV感染的细胞类型不同，这取决于不同血清型的AAV靶向细胞表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输途径 AAV病毒的糖苷受体和辅助受体 AAV血清型