芒柄花苷对人体肠道细菌生长的影响.docxVIP

芒柄花苷对人体肠道细菌生长的影响 人体肠道菌群对药物的代谢影响与药物对肠道菌群生长的影响有关。正常情况下, 不同菌种间相互依存、相互制约, 在质和量上形成一种动态生物平衡, 构成了肠道的生物屏障, 是人体保持健康状态的一个重要环节。倘若疾病或药物滥用等情况会导致敏感肠道菌的生长被抑制, 而未被抑制的肠道菌就会趁机大量快速繁殖, 从而引起肠道菌群失调, 而肠道的菌群失调又可加重病情或诱发多种疾病。因此安全性高的口服药物不仅对机体本身无严重不良反应, 而且对肠道微生物群的平衡也不应有严重影响。目前关于肠道细菌对药物的代谢研究较多, 药物对肠道细菌生长影响的研究却鲜见报道。换言之, 偏重于药物经肠道细菌代谢后代谢产物的寻找及其活性的研究, 忽略了药物及其代谢产物对肠道细菌生长以及可能对机体健康状况产生的影响研究。 芒柄花苷是中药黄芪、甘草、红芪、葛根等药材中黄酮类化合物的代表性成分, 具有促进皮肤生长、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、维持血中NO浓度和保护缺血再灌注损伤、增强免疫等多种药理活性。目前, 已有大量关于灌胃补阳还五汤或当归补血汤后大鼠血浆中芒柄花苷的药代动力学研究的报道, 但有关人体肠道细菌对芒柄花苷的代谢和芒柄花苷对人体肠道细菌生长的影响研究都未见报道。本文采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术 (UPLC-Q-TOF/MS) 与MetabolynxTM软件寻找芒柄花苷与人体肠道混合菌及分离的单菌培养后的代谢产物;采用选择性培养基分别培养得到人体代表性的4类细菌 (肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌) , 并采用光比浊法测定加入不同浓度芒柄花苷溶液后这4类细菌的生长变化, 从而推测芒柄花苷对人体肠道菌群平衡的影响, 为揭示服用含有芒柄花苷成分的中药体内作用机制提供科学依据, 也可为相似研究提供借鉴。 细菌分离、培养 仪器与试药 UPLC AcquityTM系统 (Waters公司) ;SynaptTMQ-TOF质谱仪 (Waters公司) , 配有电喷雾离子源 (ESI) ;Masslynx 4.1质谱工作站软件 (Waters公司) ;Metabo LynxTM分析软件 (Waters公司) ;Perkbn Elmer酶标仪 (Enspire公司) 。伊红美兰琼脂培养基 (编号:HB0107) 、肠球菌琼脂培养基 (编号:HB0133) 、双歧杆菌BS培养基 (编号:HB0394) 、乳酸杆菌LBS培养基 (编号:HB0385) 均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;芒柄花苷 (纯度>98%) 购自上海融禾医药科技有限公司 (批号:130531) ;乙腈 (Tedia) 色谱纯;甲酸 (Merck) 色谱纯;其余试剂为分析纯。 普通厌氧培养液 (GAM) 的配制及灭菌 精密称取胰蛋白胨10.00 g、大豆蛋白胨3.00 g、朊胨10.00 g、酵母浸膏5.00 g、血清消化粉13.50 g、牛肝浸出粉1.20 g、牛肉膏2.20 g、葡萄糖3.00 g、KH2PO42.50 g、Na Cl 3.00 g、可溶性淀粉5.00 g、L-半胱氨酸盐0.30 g和硫代乙醇酸钠0.30 g, 用超纯水加热溶解, 调节至p H 7.2并最终定容至1 L。精密称取Na Cl 2.70 g用超纯水定容至300 m L。将厌氧培养液及生理盐水在121℃高压蒸汽灭菌20 min, 冷却后用于人体肠道细菌的分离。 选择性培养基的配制及灭菌 精密称取伊红美兰琼脂干粉37.40 g和肠球菌琼脂干粉56.25 g, 分别加热溶解于1 L蒸馏水中, 121℃高压灭菌15 min, 冷却至适宜温度, 分别用于肠杆菌和肠球菌的分离;精密称取双歧杆菌BS培养基68.90 g, 再吸取1.0 m L的吐温-80, 加热溶解于1 L蒸馏水中, 116℃高压灭菌30 min, 冷却至适宜温度后用于双歧杆菌的分离;精密称取乳酸杆菌LBS培养基84.00 g, 再吸取1.0 m L的吐温-80, 加热溶解于1 L蒸馏水中, 118℃高压灭菌15 min, 冷却至适宜温度后再加入冰醋酸1.3 m L, 充分混合, 用于乳酸杆菌的分离。 对照品溶液的配制 精密称取芒柄花苷对照品适量, 用超纯水超声溶解, 配制成5.0 mg·m L-1的对照品溶液, 于4℃保存备用。 人体肠道菌液的制备及细菌的分离、培养 收集健康女性志愿者 (受试者无肠道疾病或代谢性疾病史, 且在采样前3个月内未服用过任何抗生素或益生素) 的新鲜粪便5.0 g, 与生理盐水按比例1∶4 (g∶m L) 混合, 涡旋2 min制成混悬液, 再1 000 r·min-1离心10 min得上清液, 即为肠道菌液。 将肠道菌液加到生理盐水中连续稀释, 吸取适当浓度的稀释液0.1 m L分别接种在GAM琼脂