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三种线虫不同干燥装置扫描电镜比较研究 蠕虫分类是研究有益昆虫和有害昆虫的基础。扫描电子显微镜是线虫分类研究中不可缺少的工具,它克服了光学显微镜分辨率受光波长限制的局限,可以观察到比0.2μm更小的精细结构。 在线虫的扫描电镜样品制备中,若固定、脱水和干燥环节技术不当,会引起线虫体表严重变形,从而影响观察和鉴定结果。目前对斯氏科和异小杆科线虫的扫描电镜制样技术研究和应用较多,而对一类新挖掘出来的、可用于生物防治的小杆科线虫和植物线虫研究较少。 在斯氏科和异小杆科线虫的扫描电镜鉴定工作中,用戊二醛-锇酸双固定的方法固定线虫,结合CO2临界点干燥法,制备线虫样品,可以获得较清晰的电镜照片。关于小杆科线虫,Stock曾用相同的方法对哥伦比亚小杆线虫Rhabditis(Oscheius)colombiana n.sp.进行尝试,也得到较清晰的图像。但是,对小杆科其它种的线虫用上述方法是否可行,并且用近年来应用较多的真空冷冻干燥法是否更适合于小杆线虫;另外,一些植物样本的固定可以仅用戊二醛,不用剧毒的锇酸,线虫是否也可以仅用戊二醛固定。针对上述问题,本研究分别比较了戊二醛固定和戊二醛-锇酸双固定技术、CO2临界点干燥和真空冷冻干燥技术及相互组合技术在线虫扫描电镜样品制备中的应用,结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 实验线虫 本实验室采集分离的小杆线虫Tumian品系,三等齿属无花果品系,根结线虫。 1.2 使用设备 KDQX-120型多槽式超声波清洗机、GFD-320型真空冷冻干燥仪、日立S-3400N型扫描电子显微镜。 1.3 实验方法 1.3.1 洗过 将每种线虫的成虫约100条均匀挑入4个装满蒸馏水的1.5 mL离心管中,分别记为1、2、3、4号样品。样品在超声波中清洗10 s。 1.3.2 离心管内的线虫 对4个离心管中的线虫样品分别进行4种处理。 样品1离心管中的线虫用于处理1:戊二醛-锇酸双固定、真空冷冻干燥; 样品2离心管中的线虫用于处理2:戊二醛-锇酸双固定、CO2临界点干燥; 样品3离心管中的线虫用于处理3:戊二醛固定、真空冷冻干燥; 样品4离心管中的线虫用于处理4:戊二醛固定、CO2临界点干燥。 1.3.3 固定 1.3.3. 酸溶液5%戊二醛 将样品1、2离心管中的线虫挑入加有1 mL磷酸缓冲液的工作室(图1)中,每隔0.5 h分别加入0.3 mL、0.3 mL和0.4 mL的5%戊二醛,使线虫充分浸入在终浓度为2.5%的固定液中,然后在通风橱中逐滴加入2%的锇酸直到完全浸没线虫,处理12 h后缓冲液清洗。 1.3.3. 样品处理和清洗 将样品3、4离心管中的线虫挑入加有1 mL磷酸缓冲液的工作室(图1)中,每隔0.5h分别加入0.3 mL、0.3 mL和0.4 mL的5%戊二醛,使线虫充分浸入在终浓度为2.5%的固定液中。 样品处理24 h后缓冲液清洗。上述步骤在4℃下进行。 1.3.4 脱水 经不同处理的4个样品依次用10%、30%、50%、70%、90%和100%的酒精逐步脱水,每次15min,100%的酒精处理3次。 1.3.5 样品处理与干燥 样品1、3离心管中的线虫用叔丁醇溶液置换3次用于真空冷冻干燥法干燥,样品2、4离心管中的线虫用纯乙酸异戊酯溶液置换3次用CO2临界点干燥法干燥。 1.3.6 粘性台喷金 将干燥后的线虫逐条用沾有指甲油的挑针粘在导电胶上,喷金。 2 小杆线虫结构鉴定特征 扫描电镜下观察显示不同制样方法获得的图像差异很大。对昆虫线虫的鉴定关键特征头部乳突和身体侧线,根结线虫的鉴定特征会阴花纹比较如下 经戊二醛-锇酸双固定、真空冷冻干燥处理的小杆线虫和三等齿线虫体饱满,体表变形较小,表皮光滑。小杆线虫头部柱形口腔未变形,身体前端环纹可见,唇瓣、侧唇瓣的内乳突和侧感器清晰,且虫体较干净(图2a);小杆线虫的侧线纵脊为3条,虫体饱满(图3a)。三等齿线虫口腔六个唇瓣各自分开明显清晰,唇瓣乳突形状圆形(图4a);身体环纹清晰,侧线4条~5条(图5a)。 经戊二醛-锇酸双固定、CO2临界点干燥处理的小杆线虫虫体轻微变形,头部有凹陷,体节环纹横向皱缩,使得1个体节看似2个体节,具有骨化特征的口腔及柱形乳突结构清晰(图2b);侧线中部突出,整个侧线布局能够看清,但效果不如处理1的图像(图3b)。三等齿线虫虫体也有轻微皱缩,但是主要鉴定特征清晰明显,头部口腔及乳突特征完好(图4b);侧线两边凹陷,分布不均(图5b)。 而经戊二醛固定、真空冷冻干燥处理的小杆线虫虽口腔乳突特征仍保留,体表却严重皱缩(图2c),侧线特征彻底缺失,条数布局不清楚,侧线变形挤到一起(图3c)。三等齿线虫头部形态特征依稀可见,唇瓣分布清楚,但乳突特征缺失(图4c),侧线条纹走向清晰,身体环纹呈横向凹陷(图5c)。 戊二醛固定