TTC染色鉴定葡萄抗寒性方法的优化与应用.docx

? ? TTC染色鉴定葡萄抗寒性方法的优化与应用 ? ? 王涵雅，李 欣，毛 娟，马宗桓，韦霞霞，陈佰鸿 (甘肃农业大学 园艺学院，兰州 730070) 中国北方的冬季低温会对葡萄生长造成严重影响[1]。多年来，在葡萄对低温信号的转导及其应答机制方面开展了大量研究，以期为葡萄抗寒性评价和抗寒品种选育提供理论依据。低温胁迫会对细胞膜结构造成严重破坏，从而引起电解质外渗、相对电导率增加。通过测定不同温度梯度下植物组织的相对电导率来拟合Logisitic方程，计算出半致死温度(LT50)，可有效预测植物的抗寒性[2]。电导法由于操作简便，已成为目前植物抗寒性评价中使用最广泛的方法之一，在苹果[3]、梨[4]、葡萄[5]等果树的抗寒性鉴定中均得到运用。然而，此法在具体操作时易受浸泡时间、温度以及空气中CO2的溶解等因素的影响，会出现结果重复性较差、与田间实际的抗寒性表现不一致等问题[6]。 氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)是一种显色剂，有活力的细胞可在还原酶的作用下将其还原为一种不溶于水的红色物质三苯基甲臢(triphenylmethylzan，TTF)[7]，显色程度可以用来判断植株的活力大小。TTC染色指数法是根据低温胁迫后植株TTC染色等级对抗寒性进行评估。有学者对低温处理后的橡胶枝条进行TTC染色，将染色级数与田间实际抗寒性进行比较，证明TTC染色级数法准确可靠[8]。目前此法在核桃[9]、杜仲[10]、葡萄[11]等植物的抗寒性评价上也有报道，但仍存在横截面染料堆积、目测数据不准确等问题。赵滢等[12]在葡萄枝条中运用TTC染色法时将观测面由横切面改为纵切面，并利用扫描仪和图片处理软件联用的方法将染色结果进行可视化分析和数据量化，但仍存在染色时间较长、扫描图片不清晰等问题。 单一的生理生化指标往往不能准确反映出植物的实际抗寒能力，因此通常选取多个指标(如可溶性糖、可溶性淀粉、脯氨酸、水分等)进行测定，从而较为全面地反映出植物的真实抗寒水平，准确地对植物抗寒性进行鉴定。常用的综合评价法有主成分分析法和隶属函数法。 已在杏[13]、葡萄[14]和猕猴桃[15]等多种果树中得到应用。范宗民等[16]在对葡萄枝条的抗寒性鉴定中测定了可溶性蛋白、脯氨酸、抗氧化酶等多个指标，所得综合隶属度可以准确反映枝条的抗寒性。但此法在鉴定大量种质时相对费时费力。 鉴于以上情况，我们优化了葡萄枝条TTC染色条件，并选择6个葡萄品种一年生枝条为试材，以低温胁迫后枝段纵切面染色面积为判断标准，结合Logistic方程对其抗寒性进行综合评价；同时与电导法、隶属函数法获得的抗寒性评价结果进行比较，以此来验证用枝段纵切面染色面积拟合LT50进行抗寒性鉴定的可行性和准确性，旨在建立一种简便、可靠的葡萄休眠期抗寒性评价方法。 1 材料和方法 1.1 试验材料 从甘肃省武威市林业科学研究院酿酒葡萄品种园采集 ‘左山1号’、‘黑比诺’、101-14、3309C、140R和SO4 6个葡萄品种和砧木。该区地处河西走廊东端(38°02′32″N，102°42′19″E)，海拔1 632 m，属温带大陆干旱性气候，以沙质土壤为主。年平均温度7.8 ℃，无霜期150 d，年蒸发量2 135 mm，年均日照时数2 725 h。葡萄株行距为0.7 m×3.0 m，浅沟栽植，沟深30 cm，沟宽80 cm，沟长70 m，东西行向，单臂篱架整形，架高1.7 m。 1.2 材料低温处理 于2020年11月上旬采集各品种长势一致的一年生枝各50枝，每枝长40 cm，室外沙藏30 d备用。材料的低温处理参照张倩等[17]的方法，并稍作改动。供试材料表面清理干净后用保鲜膜包裹，添加标签，放入超低温冰箱，分别在0 ℃、-14 ℃、-19 ℃、-24 ℃、-29 ℃和-34 ℃的温度下冷冻，缓慢降温至目标温度后放置24 h，随后缓慢升温到4 ℃后放置8 h，然后于室温下再放置8 h，升降温速率均为4 ℃/h。分别刮取韧皮部与木质部，在液氮中速冻后迅速移至-80 ℃冰箱保存，用于后面生理指标的测定。随机抽取3个枝条为1个处理，重复3次，以0 ℃处理下的材料为对照。 1.3 相对电导率拟合葡萄枝条半致死温度 Y=K/(1+ae-bx) 方程中Y代表相对电导率，a、b是方程参数，K为常数，由于Y是累积频率，此处K取100，LT50即方程拐点，计算方式为：LT50=-(lna/b) 1.4 TTC活力染色面积拟合葡萄枝条半致死温度 1.4.1 葡萄枝条TTC活力染色条件优化选择长势良好和粗细均匀的一年生枝条清洗干净，避开芽眼剪成0.5 cm厚的茎段，取8个放入10 mL离心管中，加入0.5% TTC-0.1 mol/L磷酸缓冲染色液没过枝条。