3株猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆及序列分析-《江苏农业科学》(2019年20期).docx

龙源版权所有 3株猪流行性腹泻病毒S1基因的克隆及序列分析作者：王婧 孙志雯 陈海峰 陈晓兰来源：《江苏农业科学》2019年第20期 摘要：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可感染各阶段的猪，使患病动物出现水样腹泻、呕吐，并伴随厌食和精神沉郁等临床症状，对哺乳仔猪危害尤为严重。为了解河南某猪场PEDV流行毒株S1基因的变异情况，以江苏农牧科技职业学院动物药学院实验室保存的感染PEDV临床病料为样本，对其进行S1基因扩增、克隆以及序列分析。对S1基因的进化分析结果显示，该猪场PEDV分离株S1基因推导的氨基酸序列之间的同源性高达99%，BLAST搜索结果显示与AHCZ-2株的相似性最高，将获得序列与经典毒株CV777相比在第57位插入了4个氨基酸NQGV，在第134位插入1个氨基酸D，而在第157、158位缺失2个氨基酸，在中和表位区域共有11处氨基酸突变，与国内其他毒株均位于G2-b进化分支，研究结果为进一步掌握该地PEDV的流行毒株和毒力變异情况提供了理论依据。 关键词：猪流行性腹泻病毒;S1基因;遗传进化 中图分类号： S855.3文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）20-0099-04 猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）以急性肠炎为特征，在仔猪常由于致死性水样腹泻导致脱水死亡的高致死率疾病[1]。病原为猪流行性腹泻病毒（PEDV），该病毒可感染各阶段的猪，使患病动物出现水样腹泻、呕吐，并伴随厌食和精神沉郁等临床症状。仔猪的感染率可达100%，而母猪则不一定[2]。腹泻时的排泄物可在48 h内检测到PEDV病毒，甚至有时可延长至4周。PEDV可感染1周龄以内仔猪，引起严重水泄和3～4 d呕吐，随后出现严重脱水和电解质失衡而造成死亡，平均死亡率可达到50%，在1～3日龄仔猪死亡率甚至可达到100%，然后降低至10%。虽年龄大一点的猪比1周龄以内的仔猪初发时发病更轻，然而PEDV影响育肥猪的生长。母猪可能不会腹泻，但是通常会显示抑郁和厌食[3]。 PEDV是一个大的有囊膜RNA病毒，属于尼多病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）成员，其基因组共约28 kb，拥有5′端非翻译区和3′端非翻译区，共编码至少7个开放阅读框（ORF1a，ORF1b，ORF2～6）其中ORF1a和ORF1b共占了整个基因组5′端2/3用于编码非结构蛋白。剩余的3′端的基因共编码4个结构蛋白，分别是纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、小膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。其中S蛋白是病毒子包膜主要的envelope Ⅰ型糖蛋白，与病毒入侵以及刺激并诱导宿主产生中和性抗体密切相关。S蛋白可划分为S1（1～735 aa）和S2（736～1383 aa）2个结构域，蛋白S1结构域对于识别pAPN受体至关重要。PEDV进入细胞始于与pAPN结合，随后通过直接膜融合的方式与靶细胞完成内化的过程，随后并脱壳释放病毒基因组进入细胞内开始复制[4-6]。 另有研究表明，冠状病毒S蛋白的变异将会导致其宿主范围、组织细胞培养基毒力发生改变。其中存在较高变异性的主要是S1基因，不同分离株S1基因间存在不同程度的核苷酸插入、突变和删减等现象，进而改变病毒原始抗原特性，因此常被用来研究不同时间和地区流行毒株的亲缘关系[7]。 本研究于2017年12月至2018年3月在江苏农牧科技职业学院动物药学院实验室开展，主要对该实验室保存的猪流行性腹泻病料进行S1基因克隆，并运用DNAMAN、MEGA等基因分析软件进行序列分析，为进一步掌握PEDV的流行毒株和毒力变异情况提供理论依据。 1材料与方法 1.1样品的采集 试验用病料为笔者所在实验室保存的感染流行性腹泻病毒仔猪肠道样品。 1.2试剂 PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）一步法RT-PCR试剂盒、EX Taq酶、Marker DL 2000、Marker DL 5000、pMD18-T载体等，均购自TaKaRa宝日医生物技术有限公司;Trizol试剂，购自Invitrogen公司;普通质粒提取，购自天根生化科技有限公司;琼脂糖，购自西班牙Biowest公司;其他试剂均为国产分析纯。 1.3样品处理及RNA提取 取保存病料的小肠组织加入适量液氮进行研磨稀释后，于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。吸取离心后上清液按照Trizol试剂提取RNA的操作步骤进行，最后将RNA溶解至DEPC水溶液中，于-20 ℃保存。 1.4引物的设计 根据CV777毒株