蛋白组学二维电泳.ppt

第一页，共二十五页，2022年，8月28日 第二章 二维电泳与蛋白质分离 一、蛋白质的提取与样品制备 二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳维等电聚焦电泳 三、胶上蛋白质检测技术 第二页，共二十五页，2022年，8月28日 蛋白质染色方法 胶内：考马斯亮蓝R-250 (CBB R-250)、CBB G-250、银染、负染、荧光染料染色以及放射性同位素标记等 转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S) 第三页，共二十五页，2022年，8月28日 （一）考染（考马氏亮蓝染色） 1、考马氏亮蓝与蛋白质反应机理 考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20 μg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。 2、考染机理 胶体内染料和溶液中自由扩散染料间形成平衡后，溶液中少量自由染料穿透凝胶基质，有选择性地对蛋白质进行染色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了背景的生成。胶内蛋白质染色的关键是让蛋白质染色，而胶体不染色。 第四页，共二十五页，2022年，8月28日 Coommassie Brilliant Blue G-250 第五页，共二十五页，2022年，8月28日 3、考染程序 考染程序至少600多种，主要变换是将以下程序中的醋酸换成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基侧链不可逆酯化，造成肽谱数据复杂化。（1）固定：凝胶浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至少1h，可过夜。（2）染色：凝胶浸泡于染色液中至少2h。染色液组成：45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考马氏亮蓝G-250，混均过滤。（3）脱色：多次更换脱色液，直至背景脱净，稍稍提高温度可加快脱色。脱色液组成：25%乙醇+8%冰醋酸。（4）保存：凝胶脱色后水洗扫描备份，用保鲜膜包裹，一个月内进行质谱鉴定；长时间保存需将蛋白点切下，进一步脱色后贮于-80 ℃。 第六页，共二十五页，2022年，8月28日 4、考染特点 （1）可以获得无背景或低背景的图谱；（2）染色过程需24-48h，所需时间较长；（3）灵敏度不高，为100-10ng，只能检测10- 100ng 的蛋白质，低丰度的蛋白质难以显色。 第七页，共二十五页，2022年，8月28日 （二）银染 1、原理： 碱性银氨（Ag(NH3)2+）染色法和酸性硝酸银（AgNO3）染色法。 酸性硝酸银染色法的原理是一个照相的过程，凝胶在酸性环境下与硝酸银温育，银离子附与蛋白质表面，然后在碱性环境下里用福尔马林还原成金属银。 碱性银氨染色法的原理是用氨水来形成银氨复合物，银氨复合物与胶内SDS-蛋白质复合物结合，然后在酸性条件下用福尔马林将银氨还原成金属银。 第八页，共二十五页，2022年，8月28日 2、特点 （1）酸性银染染色背景浅、容易控制，对酸性蛋白质的染色灵敏度稍高，碱性银染灵敏度稍高，但背景深、不容易控制。 （2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。 （3）但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽谱提取存在困难；增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。 第九页，共二十五页，2022年，8月28日 3、程序 1. 分析型银染（不能用于质谱鉴定） (1) 水洗胶5 min；(2) 40%乙醇，10%乙酸固定1 hr；(3) 5%乙醇，5%乙酸固定过夜；(4) 水洗20 min两遍；(5) 5%戊二醛 1hr；(6) 水洗30 min四遍；(7) 250mL新鲜配制的银氨液(1mL NaOH 与5mL 饱和氨水混合再加10mL 20%AgNO3)/胶45 min；(8) 水洗3 min三遍；(9) 1.5mL 1%柠檬酸、125μL 37%甲醛/胶显色；(10) 5%乙酸停显10min；(11) 水洗10 min三遍。 第十页，共二十五页，2022年，8月28日 2. 快速银染（和质谱鉴定相匹配） 第十一页，共二十五页，2022年，8月28日 （三）负染 1、特点（1）负染能提高SDS胶上蛋白质的回收率，常用有铜染、锌-咪唑染等。负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。（2）显色过程仅需5-15min（3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子就可转移出蛋白