应用荧光原位杂交技术检测康柏西普基因在CHO细胞染色体上的-遗传.PDF

Hereditas (Beijing) 2017 年 4 月, 39(4): 326 ―332 研究报告 应用荧光原位杂交技术检测康柏西普基因在 CHO 细胞染色体上的整合状态 1 2 2 2 1 师明磊 ，赖维莉 ，易天红 ，柯潇 ，赵志虎 1. 军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071； 2. 成都康弘生物科技有限公司，成都 610037 摘要 : CHO 细胞是常用的哺乳动物表达工程细胞。外源基因整合至CHO 细胞染色体后，在大规模蛋白质生产 过程中，由于相关压力撤除，外源基因存在丢失的可能，因此有必要对其整合稳定性进行检测。康柏西普 (conbercept)是一个能够特异性结合 VEGF-A 的各种异构体、VEGF-B 以及PlGF ，从而发挥抗血管生成活性的 融合蛋白。康柏西普目前已在美国进入Ⅲ期临床试验。本文运用荧光原位杂交对康柏西普基因在 CHO 细胞的 整合状态进行了检测，发现经过 4 和 19 次传代后，康柏西普基因依然能稳定整合在基因组上，并且呈现出 3 个特点：( 1)分布在一条染色体上，而不是多条染色体上；(2)分布在较长的染色体上；(3)在同一染色体上有较 多拷贝数。同时，荧光定量PCR 结果证明基因拷贝数无明显改变，ELISA 检测证明蛋白表达水平亦无明显改 变。上述实验证明在经过 19 次传代以后，康柏西普基因仍然稳定整合在基因组中，并可活跃表达，为康柏西 普大规模生产及产品质控提供了有力依据。 关键词 : 荧光原位杂交；康柏西普；CHO 工程细胞；基因组整合 Characterization of the conbercept gene localization in DHFR- amplified CHO cells using fluorescence in situ hybridization 1 2 2 2 1 Minglei Shi , Weili lai , Tianhong Yi , Xiao Ke , Zhihu Zhao 1. Beijing Institute of Biotechnology , Beijing 100071 , China; 2. Chengdu Kanghong Biotechnology Co. Ltd ., Chengdu 610037, China Abstract : Chinese-hamster ovary (CHO) cells are most widely used for mammalian protein expression. After inte- gration into the CHO genome, the exogenous gene may be lost in the process of large-scale protein production due to the removal of related selection pressures. Therefore, it is necessary to test its stability in the genome. Conbercept is a fusion protein that specifically binds to the various isoforms of vascular endothelial growth factor (VEGF)-A, VEGF-B, and placental growth factor (PlGF), thereby exerting anti-angiogenic activities. It has been approved for Phase Ⅲ clinical trials in the United States. In this study, fluorescence in situ hybridization (FISH) was used to lo- 收稿日期: 2016−10−08; 修回日期: 2017