宽谱噬菌体NTHP01的生理特征及噬菌作用-《江苏农业科学》(2019年3期).docx

龙源版权所有 宽谱噬菌体NTHP01的生理特征及噬菌作用作者：吕孙建　袁雪梅　刘莉　卢淑娟　杭小英　施伟达来源：《江苏农业科学》2019年第03期 摘要：针对1株从中华鳖养殖塘中分离得到的宽谱噬菌体NTHP01（保藏号：CGMCC No. 9623），对其感染复数、潜伏期和裂解期、热稳定性、pH稳定性等理化特性展开研究，探讨了氯化镁促噬菌体感染的最佳浓度，并考察了该噬菌体的噬菌谱。结果显示，噬菌体NTHP01的最佳感染复数为0.01，潜伏期和裂解期分别为150、60 min，最适温度为 30 ℃，最适pH值为7，氯化镁终浓度为4 mmol/L时对噬菌体的感染促进作用最佳。此外，结果显示噬菌体NTHP01宿主范围宽，能够有效抑制来自不同水产养殖品种的细菌，包括嗜水气单胞菌、脑膜脓毒性黄杆菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血性弧菌、维氏气单胞菌、腐败希瓦菌、温和气单胞菌等。研究结果为噬菌体NTHP01的规模化制备及今后在水产养殖细菌性病害防治中的应用奠定了良好基础。 关键词：噬菌体;生理特征;抑菌作用;宿主范围 中图分类号： S947.1+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）03-0132-03 细菌性病害是水产养殖的常见病害，长期以来，抗生素在水产养殖病害防治中发挥着重要作用，但由此引发的耐药菌增加、药物残留、水体环境生态问题等不良后果[1-2]，已引起社会的广泛关注，无抗生素养殖的技术支撑需求凸显。噬菌体作为天然的生物抗菌制剂，具有见效快、无毒害、无污染等特点，可能替代抗生素在水产养殖细菌性病害防治方面发挥重要作用。噬菌体是一种以细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物作为宿主的病毒，因此在许多细菌聚集的区域都能找到噬菌体，它能够特异性地杀死宿主菌，达到预防和治疗的目的。噬菌体作为细菌性病害控制的方法之一，相关研究已在医学、畜牧及水产养殖等领域被关注和重视。2005年，Bruttin和Brussow[3]临床试验验证了噬菌体在使用、治疗过程中的安全性。目前，已有的文献报道发现噬菌体对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[4]、沙门氏菌（Salmonella）[5]、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[6]等细菌均有较好的抑制效果。 本实验室从中华鳖养殖塘中分离纯化获得1株噬菌体NTHP01（保藏号：CGMCC No. 9623），前期研究发现对中华鳖一些细菌性病害有较好的防治作用。为进一步拓展该噬菌体在水产养殖中的应用，本研究对该噬菌体最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI）、潜伏期、暴发期、热稳定性、pH稳定性等理化特性进行测定，同时还探讨了阳离子化合物氯化镁促进噬菌体感染的最佳浓度，以及噬菌体对水产养殖常见致病菌的抑菌效果，为后续规模化生产并应用于水产养殖病害防控奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株 试验所用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、脑膜脓毒性金黄杆菌（Elizabethkingia meningoseptic）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）分离自中华鳖养殖池，副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）分离自南美白对虾养殖池，腐败希瓦菌（Shewanella putrefaciens）分离自红螯螯虾养殖池，温和气单胞菌（Aeromonas sobria）分离自鲈鱼养殖池，试验用细菌均保存于浙江省淡水水产研究所。 1.1.2 培养基 噬菌体培养按试验内容不同分别采用TSB液体培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）、固体培养基（琼脂浓度为2%）和半固体培养基（琼脂浓度为1.2%）进行培养。 1.2 方法 1.2.1 最适感染复数（MOI）测定 感染复数（multiplicity of infection，MOI）是指感染时噬菌体与指示菌数量的比值。将已知浓度噬菌体稀释至1×108 PFU/mL，再进行10倍梯度分别稀释至1×107、1×106、1×105 PFU/mL;同时将宿主菌（维氏气单胞菌）摇至1×108 CFU/mL，同样稀释至1×107、1×106、1×105 CFU/mL。按表1进行7个不同MOI（1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001）各取100 μL在 1.5 mL Eppendorf管中混合，再加入800 μL新鲜TSB培养液，28 ℃培养3.5 h。取出后分别测定各管中噬菌体效价，3.5 h 滴度最高所对应的MOI即为最适感染复数。 1.2.2 一步生长曲线测定 将噬菌体按最适MOI与宿主菌（维氏气单胞菌）按1 ∶ 1混合，