马哈利樱桃根际产吲哚乙酸细菌多样性及产素能力研究-《江苏农业科学》(2017年20期).docx

龙源版权所有 马哈利樱桃根际产吲哚乙酸细菌多样性及产素能力研究作者：赵柏霞 闫建芳 夏国芳 李俞涛 潘凤荣来源：《江苏农业科学》2017年第20期 摘要：分离6年生砂蜜豆/马哈利樱桃的根际细菌，通过16S rDNA基因序列分析确定分类地位，利用比色法筛选IAA产生菌并定量检测其产素能力。研究发现，共分离获得52株细菌，分属于2个类群11个属的17個种。对各代表菌株进行产素能力测定，共发现15株菌可分泌生长素，其中A07、A20、B20及B26菌株具有较强的产素能力。马哈利砧木作为辽东地区甜樱桃的主要砧木，其根际促生菌的多样性分析及菌株利用研究较少，本研究为甜樱桃增产及生物菌肥开发提供了重要菌株资源。 关键词：马哈利樱桃；根际细菌；多样性；吲哚乙酸；产素能力 中图分类号： S662.501 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0169-04 植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）指生存于植物根际、根表，并能直接或者间接促进或者调节植物生长的微生物。这类微生物一般具有固氮、解磷、产生植物激素等能力或者至少其中之一的能力。1978年，研究人员首次在马铃薯上发现并报道了PGPR，经过了30多年的发展，这类菌被大量报道，其中包括了假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、固氮螺菌属（Azospirillum sp.）[1]、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）[2]、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）[3-4]、固氮菌属（Azotobacter sp.）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）[5]、节杆菌属（Arthobacter sp.）[6]、布克霍尔德氏菌属（Burkholderia sp.）[7]等。这些菌种部分已经作为新型肥料的菌源在农业生产中开发利用。Kumar等从葫芦巴的根瘤中分离的E. meliloti 和R. leguminosarum具有多重促生活性，并对Fusarium oxysporum具有一定的拮抗作用[8]。王光华等从大豆根际土壤分离到一株芽孢杆菌BRF-1，该菌对7种病原菌有较好的拮抗作用[9]。 马哈利[Cerasus mahaleb （L.） Mill.]是一种欧美普遍应用的甜樱桃砧木，该种樱桃根系发达，固地性好，耐旱、耐寒、耐贫瘠，是我国北方重要经济作物甜樱桃的主要嫁接砧木[10]。其根际促生菌的种类及数量对于甜樱桃产量有重要影响。但目前辽东地区对于该砧木根际微生物及PGPR菌的研究尚未见报道，其研究对甜樱桃的增产及品质提高具有重要意义。 本研究对6年生砂蜜豆/马哈利樱桃树的根际细菌进行分离鉴定，并以植物生长素吲哚乙酸（IAA）为指标进行产素能力测定，筛选到了马哈利根际促生细菌并明确了其产素能力，为生物促生菌肥的开发利用提供了丰富的资源。 1 材料与方法 1.1 土壤样品 土壤样品采集自辽宁省大连市农业科学研究院甜樱桃园，采集时选择生长良好的6年生甜樱桃根部土壤，除去土壤表面覆盖的凋落物及杂物，铲除表面约5 cm厚的土壤，用灭菌铲采集5～20 cm深的根际土壤，装于灭菌袋中，过20目筛后4 ℃保存。 1.2 培养基 分离培养基为LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。IAA检测培养基为含L-色氨酸LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，色氨酸100 mg/L，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。 1.3 菌株分离纯化 采用梯度稀释法分离土壤中细菌菌株，纯化后编号LB斜面上保存备用。 1.4 16S rDNA扩增 将菌株用LB培养液培养至对数生长期，离心收集菌体，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）提取菌株总DNA。以细菌通用引物27F/1525R（引物1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物2：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3）进行PCR扩增。50 μL PCR反应体系为Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反应条件：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环；72 ℃、5 min。PCR扩增产物采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，4S Red（上海生工）染色后，在凝胶成像系统（Bio-Rad，USA）中观察照相。 1.5 测序 16S PCR产物送往生工生物工程