新城疫病毒LaSota疫苗株的准种遗传变异分析-《江苏农业科学》(2014年3期).docx

龙源版权所有 新城疫病毒LaSota疫苗株的准种遗传变异分析作者：吴双等来源：《江苏农业科学》2014年第03期 摘要：为开展新城疫病毒（NDV）LaSota疫苗株的反向遗传操作技术研究，了解该病毒的准种分化情况，运用鸡胚极限稀释法对NDV LaSota疫苗株进行传代纯化，选择病毒稀释度最高、血凝价较高的鸡胚尿囊液作为传代接种物，传至第5代，RT-PCR扩增序列，测定并分析其全基因组序列，阐述LaSota疫苗株准种分化情况，为基因工程疫苗的研制奠定了一定基础。 关键词：新城疫病毒；LaSota疫苗株；准种；极限稀释法 中图分类号： S852.65+7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0161-03 新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）强毒株引起的一种禽类致死性传染病，是当今世界上危害最大的家禽传染病之一[1-4]，被国际兽疫局（OIE）列为必须呈报的疫病之一。该病最常侵袭鸡和火鸡，至少250种鸟类可自然或实验室感染NDV，且强毒感染能对其造成100%的死亡率[5]。NDV属于副黏病毒科，禽腮腺炎病毒属，其基因组由单股负链RNA构成，基因组结构为 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L），其中病毒囊膜表面的2种糖蛋白F和HN是构成NDV致病性的主要分子基础[6]。对于ND疾病的控制，在发达国家以捕杀强毒感染群为主，同时结合疫苗接种，而在广大发展中国家疫苗接种仍是控制该病的主要手段。NDV经典弱毒疫苗毒株LaSota具有抗体提升快、繁殖性能良好、免疫原性好、抗体效价高、遗传稳定性好等优势，被世界各国广泛应用于雏鸡免疫。然而，在长达近百年的使用过程中，LaSota毒种被反复鸡胚传代，准种分化严重。准种是由Eigen在1971年提出的用于描述同种生物遗传异质性的概念[7]，感染个体内同种病毒的遗传异质性是RNA病毒具有的一种普遍的生物学特性，实际上是由一系列基因序列相近而又不完全相同的突变体构成的。准种是病毒基因组突变或重组的结果，是连续的遗传变异、竞争和选择所产生的[8]。 本研究使用SPF鸡胚极限稀释法对笔者所在实验室保存的NDV LaSota病毒株进行纯化，测定其全基因组序列，以揭示该毒株的准种遗传变异，这对后续开展该毒株的反向遗传学研究具有重要意義，也为基因疫苗的研制奠定了一定的基础。 1 材料与方法 1.1 病毒和鸡胚 LaSota株和NDV阳性血清购自中国兽医药品监察所，由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室保存。SPF种蛋购自山东家禽研究所SPF鸡场，由本室孵化至所需日龄。 1.2 常用分子生物学试剂和分子生物学软件 Trizol抽提试剂购自Invitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒、大肠杆菌（Escherichia coli）菌种DH5α感受态细胞、质粒小提试剂盒购自天根生物有限公司；X-Gal、IPTG、dNTPs、6 nt 随机引物等购自宝生物工程（大连）有限公司；高保真聚合酶2×LAmp MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；EcoRⅠ、DNA Markers购自Fermentas生物工程有限公司；禽白血病反转录酶、RNA 酶抑制剂、pGEM-T easy 载体vector和琼脂糖购自Promega公司；焦碳酸二乙酯购自AMRESCO公司；蛋白栋和酵母提取物购自英国OXOID公司；饱和酚、三氯甲烷、异丙醇等常规试剂购自生工生物有限公司；其余试剂均为国内分析纯；磷酸盐缓···试读结束