1株鲟源金黄杆菌的分离鉴定及药敏试验-《江苏农业科学》(2017年10期).docx

龙源版权所有 1株鲟源金黄杆菌的分离鉴定及药敏试验作者：孔杰 李小义 王艳艳 曾圣 周洲来源：《江苏农业科学》2017年第10期 摘要：为研究鲟鱼体内微生物多样性，从贵州省水产研究所惠水鲟鱼繁育基地采集鲟鱼进行微生物的分离培养，从肝脏中分离纯化获得1株优势菌株，命名为菌株Liver 5。经生理生化试验、菌体形态观察及16S rRNA序列分析，初步鉴定该菌为金黄杆菌（Chryseobacterium sp.）。人工感染试验表明，菌株Liver 5未引起鲟鱼发病死亡现象。药敏试验结果表明，菌株Liver 5对左氧氟沙星敏感，对新霉素、红霉素中度敏感，对氯霉素、青霉素-G、链霉素及头孢唑啉等21种抗生素均耐受。本研究结果对金黄杆菌引起的细菌性疾病用药治疗具有重要意义。 关键词：金黃杆菌；抗生素；生理生化；病原菌 中图分类号： S941.42文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）10-0129-04 金黄杆菌属为革兰氏阴性、无鞭毛、严格好氧生长的一类菌属，广泛分布于水体和土壤中。脑膜脓毒金黄杆菌（Chryseobacterium meningosepticum）、产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）及黏金黄杆菌（Chryseobacterium gleum）等是引起人体发病的常见条件致病菌，可引起新生儿脑膜炎、败血症及呼吸道感染等疾病的发生[1]。部分金黄杆菌株还会造成鱼蟹和畜禽等养殖动物体感染发病[2-4]。但Krause在研究金黄杆菌对萝卜生长影响时发现，黏金黄杆菌对萝卜抵抗病原菌具有积极作用[5]。Ramos在拟南芥植物根际细菌对植物抗病效果研究中发现菌株Chryseobacterium balustinum AUR9能显著减少植株疾病发生[6]。近年来，金黄杆菌的产蛋白酶、抗氧化剂及生物防治剂等功效相继有所报道。王继元从无指盘臭蛙皮肤表面分离到1株产蛋白酶的金黄杆菌CW-E2T，并对其产胞外蛋白酶的特性进行了初步研究[7]。Kim等在研究金黄杆菌对植物病原菌拮抗机理中发现菌株Chryseobacterium wanjuense KJ9C8可通过产蛋白酶和HCN等物质对胡椒根际细菌菌群产生影响[8]。 鲟鱼为高蛋白、高脂肪性鱼类，是优良的淡水鱼品种，也是现存于世界上的最珍奇和最古老的冷水性生物鱼群之一，其肉厚骨软，同时鲟鱼卵可以加工成鲟鱼籽酱，具有“黑色黄金”之称。鱼体含有多种人体必需的氨基酸，具有很高的经济价值和药用价值。目前，对鲟鱼体内微生物多样性研究较少。本研究从贵州省水产研究所惠水鲟鱼繁育基地采集鲟鱼样品，对其体内微生物进行了分离鉴定。旨在为了解鲟鱼微生物多样性、筛选有益微生物及细菌性疾病治疗提供参考。 1材料与方法 1.1主要试剂 按常规方法自配LB（Luria-Bertani）固体培养基和水解酪蛋白琼脂（MH）培养基；细菌基因组DNA提取试剂盒、Taq DNApolymerase、dNTP等，购自TaKaRa公司；药敏试纸片、细菌生化微量鉴定管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。 1.2样品采集与菌株分离 2014年7月于贵州省水产研究所惠水鲟鱼繁育基地采集鲟鱼；无菌条件下取鲟鱼肝脏，将肝脏组织在无菌生理盐水中研磨均匀，适当稀释后涂布在LB固体培养基上，28 ℃培养24 h，从中选取优势菌落进行纯化，直至获得纯培养物。 回归感染用的健康施氏鲟鱼也来自该基地，健康施氏鲟鱼放水族箱中暂养7 d，无异常后进行试验。 1.3菌株鉴定 菌株Liver 5生理生化反应鉴定方法参照文献[9]。 16S rRNA基因测序及系统发育分析：用细菌基因组DNA试剂盒提取单菌基因组DNA，扩增16S rRNA基因。16S rRNA基因正向扩增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第 8～27 个碱基位置）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向扩增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第1 512～1 493个碱基位置）：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′[10]。PCR扩增条件：95 ℃预变性5.0 min；94 ℃变性1.0 min，55 ℃復性1.0 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；最后72 ℃，温育 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳确定条带后交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。 1.4鲟鱼人工感染试验 选取健康的鲟鱼进行人工注射感染试验。菌株Liver 5过夜培养，取对数期菌液，离心收集菌体，用无菌PBS溶液洗涤2～3次，制备成菌悬液。腹腔注射菌浓度为9×108 CFU/mL，同时设置注射PBS液体的为对照组。取30尾体长为10～12 cm的鲟鱼，