生物制药工艺学第12章制备型HPL.pptxVIP

第十二章 制备型高效液相色谱第一页，共七十页。制备型高效液相色谱的用途：1重组蛋白药物生产的工艺优化、中试以及大规模生产的必备手段。第二页，共七十页。第三页，共七十页。2天然产物中活性物质发现的重要手段: 蛋白质,多肽,多糖。抗菌肽3从天然产物来源药品生产的重要手段：胰岛素，蕲蛇酶。4实验室制备样品用于临床试验和报批。5 在 2-D 电泳, blotting, ELISA 等之前的样品制备。第四页，共七十页。第五页，共七十页。第六页，共七十页。第一节 高效液相色谱法简介1.1 液相色谱的发展史 1903年，色谱法问世。俄国植物学家茨维特 1903年3月21日，大会报告 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用” 1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 第七页，共七十页。1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了1938年的诺贝尔化学奖。1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。第八页，共七十页。60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制高效填料，高压泵，仪器检测第九页，共七十页。1.2 基本仪器装置输液系统进样系统分离系统检测系统收集系统数据处理系统第十页，共七十页。第十一页，共七十页。2 1 高效液相色谱仪组成1 输液系统 (1) 高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。第十二页，共七十页。第十三页，共七十页。(2)在线脱气装置作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气 装置再输送到色谱柱。超声脱气、真空脱气等脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。O2, N2, CO2…Pressure Dampers 第十四页，共七十页。（3）梯度洗脱装置Isocratic elution恒定组成的单一溶剂体系以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，目的是分离多组容量因子相差较大的组分Gradient elutionHigh-Pressure Mixing第十五页，共七十页。2 进样系统六通阀第十六页，共七十页。3 分离系统3.1色谱柱第十七页，共七十页。 3.2色谱柱填料基质：载体或担体。数?m~数十?m，球形。 硅胶或有机高分子聚合物spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica particle. [K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979] 第十八页，共七十页。Porous particle3-10?m1-2?m30-50?mPellicular particle第十九页，共七十页。 3.3色谱柱填料功能层：物理吸附或化学键合第二十页，共七十页。检测系统：第二十一页，共七十页。收集系统：第二十二页，共七十页。数据处理系统：第二十三页，共七十页。三、高效液相色谱法的特点采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器, 从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高 等。第二十四页，共七十页。四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别 输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能AKTA prime AKTA purifier AKTA xpress 系统泵及样品泵 泵型：单泵 流速： 0.1-50ml/min 泵压： 1Mpa 增量 : 0.1ml/min 粘度： 10cp 泵型：双泵 4 泵头高效柱塞泵 流速0.001-10ml/min 泵压： 25Mpa 流速精度< ±2μl/min 增量 : 0.001ml/min 粘度： 5 cp 泵型：高效柱塞泵 流速： 0.1-65ml/min 泵压： 3Mpa 第二十五页，共七十页。检测器中的检测池不同 ：体积不同色谱柱不同：规格主要是直径，粒径的大小第二十六页，共七十页。制备色谱一般配有电导检测器和pH值检测器分析型色谱没有：制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有第二十七页，共七十页。五、色谱的基本理论及有关参数 两大理论：塔板理论(the plate model):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2第二十八页，共七十页。速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。 H= A+Cu第二十九页，共七十页。有关参数容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔