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实验二 目的基因与质粒DNA的酶切与连接 1 实验目的 学习使用限制型内切酶进行DNA酶切和T4连接酶进行连接的原理和方法。 2 实验原理 迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。 II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC；Hind III识别AAGCTT;BamHI识别G↓GATCC; Not I识别GC↓GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoR I酶切后产生末端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末端，如HaeIII酶切后产生 5’-G↓AATTC 5’-G↓AATTC 3’-CTTAA↓G 5’-GG↓CC 3’-CC↓GG-5 DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（ 3 实验材料、仪器及试剂 3.1 实验材料与试剂 限制性酶 BamHⅠ和 Hind Ⅲ、 T4DNA连接酶及其缓冲液、 DNA琼脂糖电泳所用试剂、10×loading buffer、核酸染料GoldView、 DNA胶回收试剂盒、小指管、吸头等 3.2 仪器准备 恒温水浴锅、台式离心机、凝胶成象仪、Dark Reader荧光投射仪、旋涡混合器、电泳仪、电泳槽 4 操作步骤 4.1 酶切 （1）酶切目的基因 按如下体系混合： 反应物（μL） EGFP片段 pET-28a AKP DNA 24 24 BamH I 2 2 Hind III 1 1 10×buffer K 3 3 离心10s，混匀。37℃水浴酶切3h。 （2）酶切载体 按如下体系混合： 反应物（μL） EGFP片段 pET-28a pETBlue-2 10 10 BamH I 2 2 Hind III 1 1 10×buffer K 2 2 dd水 5 5 离心10s，混匀。37℃水浴酶切3h。 4.2 酶切产物进行琼脂糖电泳，用DNA回收试剂盒进行回收酶切产物。 4.3 检测酶切后的目的基因和质粒的浓度 4.3 连接 测定载体和目的基因的DNA浓度之后，按照连接体系进行，16℃连接过夜。 反应物 体积/μL 酶切后载体 1.5 酶切后目的基因 13.5 T4连接酶 2 缓冲液（10×） 2 dd水 1 5.实验结果与分析及感想 从图片上可看到白色条带是DNA样品所在位置 左侧泳道是DNA Marker 右侧4个泳道是DNA样品 ，其中1，2是酶切后的AKP基因，是1500bp左右，3，4是酶切后的质粒。将这四个条带进行回收并连接，导入感受态细胞转化。重组DNA 的成功构建是AKP基因克隆表达的关键所在。