感受态的制备、质粒的转化和筛选PPT课件.ppt

实验五感受态的制备、质粒的转化和筛选 实验安排 感受态的制备 质粒的转化 第二天，观察结果 质粒酶切--电泳检测 上次实验产物（质粒） 酶切电泳点样安排 电泳上样： 1、所有同学各自的酶切产物（10-20 μl） 2、每排点样孔需有两种质粒：pUC119、pUC119-U6 3、同一人的“酶切前”与“酶切后”相邻点样 实验步骤 加1.5ml培养物于EP管，4000rpm×10min 加入冰冷CaCl2溶液300 μl，重悬菌体 沉淀中加入冰冷CaCl2溶液120 μl，重悬菌体 感受态制备 冰浴15-30min， 4000rpm×10min 收集沉淀，去上清 收集沉淀，去上清（去掉培养基） 实验步骤 每管感受态中加质粒5 μl，混匀 42 ℃ ，热激90秒，勿摇动 每管加LB 500 μl，37℃摇床，复苏30-40min 铺200 μl 菌液到LB琼脂平板，涂匀 转化 冰上静置20-30min 如何设计实验的参照体系（对照组）？ 筛选 实验步骤 LB培养基（X-gal, IPTG, Amp） LB培养基 感受态+质粒（ pUC119-U6 or pUC119） 感受态（无质粒） pUC119-U6 pUC119 对照组B ？ ？ ？ 对照组A ？ 基因克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称DNA克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 基因克隆示意图 基因克隆操作过程： 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) 重组DNA导入受体菌 LB 0.18M 0.1M CaCl2 0.1M CaCl2 H2O 细胞膨胀：低渗环境 胞膜收缩：低温环境 离子扩散： DNA-Ca2＋ 热休克： 42 ℃ 1L LB培养基: 10g 胰蛋白胨 5g 酵母提取物 10g NaCl 　 　 重组体的筛选 　重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。 重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue)－ α互补（蓝白斑筛选） (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 α 互补的检测 蓝白斑筛选 感受态细胞转化效率的检验 1μg的完整质粒转化到感受态细胞中，得到的转化细菌的数量。 例如，取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞. 向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒。 转化率＝ 1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg 转化效率1×106 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×108 cfu/μg DNA * * * *