分子克隆工具酶 (2).ppt

位点偏爱（Site preference） 某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。 第三十页，共77页 1.5 限制酶的用途 1.???? 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制片断 2.???? 建立限制酶（物理）图谱绘制 3.???? 构建基因文库 4. 用限制酶切出相同的粘性末端，以便重组 第三十一页，共77页 2 DNA连接酶 2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项 第三十二页，共77页 2.1 定义及功能 DNA连接酶（DNA ligase）：可使一段DNA的3` 羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`- 磷酸二酯键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形成的切口的酶。 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。 J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶. J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\连接酶.swf 第三十三页，共77页 OH P 5` 3` 3` 5` 5` 3` 3` 5` DNA ligase DNA ligase 连接缺刻(nick) 第三十四页，共77页 DNA连接酶 连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。 第三十五页，共77页 T4 DNA连接酶(ATP提供能量）和大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量）两种。 2.2 种类及作用机理 第三十六页，共77页 大肠杆菌的DNA连接酶 大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。 第三十七页，共77页 大肠杆菌的DNA连接酶 DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后,封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。  第三十八页，共77页 噬菌体T4DNA连接酶 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。 第三十九页，共77页 AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ 5′ 5′ (1) (2) AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ (a)分子间连接 (b)分子内连接 (1) (2) AT G C T A TA G C T A T4连接酶 T4连接酶 第四十页，共77页 T4 DNA ligase 的作用机理 第四十一页，共77页 第四十二页，共77页 1)DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接； 2)只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)； 3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（gap）。 2.3 使用时的注意事项 第四十三页，共77页 思考 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子了。 第四十四页，共77页 DNA聚合酶（DNA polymerase） J:\生物视频\细胞生物学视频\DNA聚合酶\Nucleotide_Polymerization.m