实验七、血清胆固醇的定量测定(磷硫铁法).doc

实验七、血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法） 实验目的： 掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理、方法及临床意义。 实验原理： 总胆固醇的测定有化学比色法(磷硫铁法和邻苯二甲醛法)和酶学方法(试剂盒)两类。本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。 用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与硫磷铁试剂作用，产生颜色反应，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中胆固醇含量。 血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯溶解在无水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫铁试剂，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，此物质在560nm波长处有特征吸收峰，可用比色法作胆固醇的定量测定。正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100ml。 胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系。 实验讲授： 722型分光光度计的使用 722型分光光度计的使用 测量原理  分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律：当容液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c（g/l）或液层厚度b (cm) 成正比。其定律表达式A = abc（a是比例系数）。当c的单位为mol/l时，A = εbc，比例系数用ε表示，称为摩尔吸光系数。其单位为L·mol-1·cm-1，它是有色物质在一定波长下的特征常数。  T (透光率) = I/I0 A (吸光度) = -lgT 或 A = K·C·L (比色皿的厚度)  测定时，入射光I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，即“K”为常数。比色皿厚度一定，“L”、“I0”也一定。只要测出A即可算出“C”。《分光光度计的表头上，一行是透光率，一行是吸光度。》 722型分光光度计的使用  1、将灵敏度旋钮调至“1”档（信号放大倍率最小）。  2、开启电源，指示灯亮 ，选择开关置于“T”，波长调至到测试用波长。仪器预热20分钟。  3、打开试样室（光门自动关闭），调节透光率零点旋钮，使数字显示为000.0。（调节100%T旋钮），盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率100%旋钮使数字显示100.0。如显示不到100.0，则可适当增加微电流放大的倍数。（增加灵敏度的档数同时应重复（3）调节仪器透光率的“0”位）但尽量使倍率置于低档使用。这样仪器会有更高的稳定性。  4、预热后，按（3）连续几次调整透光率的“0”位和“100%”的位置，待稳定后仪器可进行测定工作。 吸光度“A”的测量  将选择开关置于A 。调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为零，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。 浓度C的测量  将选择开关由“A”旋至“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。  使用方法  （1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。  （2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。  （3）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。 （4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。  （5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。  （6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。  重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。  （7）浓度的测定 选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的浓