DB37_T 602-2006鸡蛋中四环素类残留量的测定 酶联免疫吸附法.pdf

ICS 65. 020. 30B40DB37山東东省地方标准DB37/T 602—2006鸡蛋中四环素类残留量的测定酶联免疫吸附法Determination of tetyacyclines in egg enzyme linked immunosorbent assay2005-06-28发布2006-07-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37 /T602—2006前言本标准由山东省备牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出，本标准起草单位：山东省畜产品质量检测中心。本标准主要起草人：高迎春、陈玲、冯修光、魏秀丽 DB37 /T602—2006鸡蛋中四环素类残留量的测定酶联免疫吸附法1范围本标准规定了鸡蛋中四环素类残留量的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于鸡蛋中四环素类药物的快速检测。本方法四环素、金毒素的检测限为7.0g/kg：土毒系的检测限为13.0μg/kg。该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中四环系类药物与结合在酶标板上的抗原共同竞争抗四环系类药物抗体，再通过与酵标羊抗兔抗体反应，酶标记物将底物转化为有色产物，吸光度值与试样中四环素、金毒素及土毒素浓度成反比。4材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。4.1无水甲醇（CHLOH）4. 2草酸[(COOH)2· 2H;0]4.3柠檬酸（CsH0.H:0）4.4磷酸氢二钠(Na,HPO,·12H,0)4.5乙二胺四乙酸二钠（CH,N,Na;0,)4.6氢氧化钠溶液，c【（Na0H）】=1moL/L：取氢氧化钠4.0g，加水溶解至100mL。4.7草酸甲醇溶液c【（C00H）2·2H;0）】=20mmo1/L：取草酸1.8g，加甲醇至1000ml。4.8柠橡酸一磷酸氢二钠一乙二胺四乙酸二钠缓冲溶液：分别取柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠10.9g，乙二胺四乙酸二钠37.2g，加水900mL溶解，用1mo1/L氢氧化钠溶液调pH值至3.8，稀释至1000mL.4.9四环素类药物系列标准溶液4.10酵标记物4.11抗四环素类药物抗体溶液4.12底物4.13缓冲溶液4.14洗液浓缩液4.15底物缓冲溶液4.16终止液5仪器5.1分析天平：感量0.01g。1 DB37/T602—20065.2离心机5.3微量移液器：单道1μL~100μL：多道50μl~250μL5.4均质器5.5振荡器5.6西酵标板5. 7酵标仪6测定步骤使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整，6.1试料的提取取猪肉样品约20g，以10000r/min匀浆2min，称取2g匀浆物（精确至0.01g），加入柠橡酸一磷酸多二钠乙二胺四乙酸二钠缓冲溶液（4.8）8.0mL，于振荡器上震荡30min。10000r/min离心10分钟，上清液备用。Cs固相萃取柱依次用无水甲醇（4.1）3mL、水2mL预洗。取备用液5.0mlL过柱，用水2mL淋洗。用草酸甲醇液（4.7）1.0mL洗脱，收集洗脱液。将收集的洗脱液摇勾，用稀释液10借作为试样溶液供醇联免疫法测定。6.2测试程序6.2.1取出酵标板（5.6）及所有试剂，使试剂盒温度升至室温。6.2.2洗液按1份洗液浓缩液（4.14)加9份水进行稀释。四环素系列标准溶液（4.9）、抗四环素类药物抗体溶液（4.11）、酶标记物（4.11）、底物溶液（4.12)等按1份试剂加9份缓冲液进行稀释和制备，稀释液均现配现用。6.2.3依次向微孔中加入稀释的系列标准落液（4.9)、空白试科落液、试样落液50u山，移释的抗体落液（4.11）50ul，置微型振荡器上振荡30s，用封口膜封好，孵育60min。6.2.4倒出孔内液体，将酶标板（5.4）倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体.用多道移液器加稀释的洗液浓缩液（4.14）250μL到酶联板的微孔内，然后倒出孔内液体，如此重复操作三次。6.2.5加入稀释的酵结合物100uL，孵育30min，按6.2.4重复三次。6.2.6加底物溶液100ul，避光孵育15min。6.2.7用多道移液器每孔加终止液（4.7）100μL。6.2.8将酶标板（5.4）放于酶标仪内，于450nm波长处立即测定吸光度值。以零标准吸光度值A为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以此吸光度百分比为织坐标，对应的各标准