花生金属蛋白酶家族基因FtsH的鉴定、分类和盐胁迫表达分析-《江苏农业科学》(2016年12期).docx

龙源版权所有 花生金属蛋白酶家族基因FtsH的鉴定、分类和盐胁迫表达分析作者：郑春花 孔祥远 隋炯明 束晨 赵春梅来源：《江苏农业科学》2016年第12期 摘要：FtsH是一种ATP和Zn2+依赖型金属蛋白酶，在植物抗逆胁迫中发挥了重要作用。为分析花生中FtsH家族成员情况，构建花生叶片转录组数据文库，筛选出19个FtsH家族基因，位于花生A组野生种的8条染色体上，与拟南芥、水稻的FtsH基因进行同源序列比对后发现，多数FtsH基因没有聚到已报道的亚类。利用花生耐盐突变体（S2）和对照（S4）构建盐胁迫处理前后各时间段的表达谱文库，进行FtsH基因盐胁迫表达分析，结果表明，9个FtsH基因受盐胁迫诱导表达，绝大多数FtsH基因在耐盐突变体和对照中表现出不同的表达模式。该研究为花生金属蛋白酶基因的功能研究与耐盐分子育种提供了基础。 关键词：花生；FtsH基因；基因表达谱；耐盐突变体；盐胁迫 中图分类号： S565.201文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）12-0074-03 收稿日期：2016-08-30 基金项目：国家自然科学基金（编号31301356；山东省科技发展计划（编号：2014GNC110002）。 作者简介：郑春花（1979—），女，山西忻州人，硕士，图书馆员，主要从事生物信息学分析。E-mail：zchsjm@163.com。 通信作者：赵春梅，博士，副教授，主要从事作物分子育种研究。E-mail：meiwei2002@163.com。 FtsH属于AAA蛋白酶家族，是一种ATP和Zn2+依赖型蛋白，在生物体内广泛分布[1]。FtsH负责细菌原生质膜、线粒体膜、叶绿体膜上未装配蛋白的降解，通过降解非复合体形式的自由亚基，可以避免有害物质的大量积累[2-3]。在高等植物中，FtsH蛋白参与D1蛋白光氧化损伤产物的降解，现己证实FtsH具有降解快速周转的蛋白的功能，FtsH是植物抵抗光抑制过程中PSⅡ复合物修复的关键成分之一[4]。FtsH蛋白除了作为蛋白酶发挥功能外，还作为分子伴侣参与蛋白的装配和折叠[5-7]。 已有研究表明，拟南芥的12个FtsH基因和水稻的FtsH基因可以分为8个亚族，每个亚族的成员蛋白序列高度保守，种内同源物相似性大于80%，且种间同源物的相似性也大于70%[8]。FtsH不仅参与生物体内正常的代谢调节过程，而且与多种逆境胁迫响应密切相关，有些成员在植物抵抗热激和高渗、盐害、冷胁迫和病原菌等胁迫中发挥着重要作用[9-11]。 笔者前期以花生胚小叶为外植体，通过平阳霉素离体诱变和羟脯氨酸定向筛选，获得了一批羟脯氨酸耐性苗及其后代[12]，其中1个突变体（S2）在0.7%盐溶液中发芽率超过50%，且具有较高的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性，而对照花育20（S4）在相同浓度的盐溶液中发芽率只有6.7%。 为从整个转录组水平了解花生FtsH家族基因的情况，笔者用上述材料构建花生叶片转录组文库，利用生物信息学研究手段，鉴定花生FtsH家族基因，进行FtsH基因的染色体定位和分类。然后构建耐盐突变体S2和对照S4在盐胁迫处理前后的表达谱，分析FtsH家族各成员在盐胁迫处理前后表达量的变化，为全面了解FtsH家族成员在花生中的功能以及耐盐分子育种奠定了基础。 1材料与方法 1.1材料 本研究所用材料为平阳霉素离体诱变和羟脯氨酸定向筛选后稳定遗传的耐盐突变体（S2）和对照花育20（S4）。 1.2转录组数据库构建 用250 mmol/L NaCl处理耐盐突变体S2和对照S4，在0、6、12、24、48 h取叶片，每个样品包含2个生物学重复。混合后构建转录组文库，送交北京诺和致源公司进行双向测序，组装处理后获得非冗余Unigene序列，在NCBIA数据库注册（注册号SRR3114511）。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG数据库进行基因功能注释。 1.3盐胁迫处理前后表达谱数据库构建 由北京诺和致源公司对盐胁迫处理前后20个样品进行数字化表达谱测序，构建花生叶片盐胁迫处理前后的表达谱数据库（NCBI注册号SRR3210665、SRR3210666）。 1.4基因家族成员鉴定、基因结构分析和染色体定位 根据NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG数据库的基因功能预测，搜索FtsH基因。利用生物信息学软件分析蛋白结构域、分子量、理论等电点和可能的亚细胞定位。从花生全基因组数据（http：//）下载A组野生种基因组序列，進行基因序列比对，取相似度最高的序列作为目标基因，并根据数据库的预测结果和比对结果进行基因结构分析。根据与数据库比