利用hAPOA1原核蛋白生产兔多克隆抗体-《江苏农业科学》(2016年12期).docx

龙源版权所有 利用hAPOA1原核蛋白生产兔多克隆抗体作者：徐志伟赵杰 刘伟忠刘照亭王期来源：《江苏农业科学》2016年第12期 摘要：将hAPOA1的阅读框连接到原核表达载体pGEX-4T-1中，构建成正确的pGEX-4T-1-hAPOA1原核表达质粒，然后将其转入宿主菌BL21，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后，宿主菌表达出与预期分子量大小相符的55.4 ku的融合蛋白；将纯化后的包涵体融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备抗hAPOA1血清并检测抗体效价。结果表明，经间接酶联免疫吸附测定（ID-ELISA）及蛋白质免疫印迹（Western Blot）方法证实，获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体，抗体效价为1 ∶[KG-*3]40 000，经济效益可观。 关键词：hAPOA1；原核表达；新西兰大白兔；融合表达；多克隆抗体 中图分类号： S852.5文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）12-0085-03 收稿日期：2016-08-11 基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（16）1326]。 作者简介：徐志伟（1965—），男，江苏常州人，硕士，助理研究员，主要从事畜禽养殖研究。E-mail：xzw1729@。 通信作者：王期，博士，主要从事生物技术研究。E-mail：swwq0401@163.com。 载脂蛋白A1（ApoA1）是apoA族最多的一种组分，apoA1为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，是高密度脂蛋白（HDL）的主要载脂蛋白，不仅是生物试剂的重要原料，也是抗动脉粥样硬化的指标[1]。目前，apoA1的检测多采用免疫比浊法[2]，现有的抗载脂蛋白A1抗体的生产采用传统的免疫方式（免疫原从高密度脂蛋白纯化得到，免疫动物受限等），产量、效价及特异性较差，已无法满足日益增长的使用需求。本研究构建了hAPOA1的原核表达载体，通过大肠杆菌原核表达系统进行hAPOA1的蛋白表达与纯化，并通过免疫新西兰大白兔获得了抗血清，为自主大规模生产抗hAPOA1抗体及后续的免疫检测试剂盒研发奠定了基础。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1菌种和质粒E.coli DH5α、表达载体pGEX-4T-1、E.coli BL21（DE3）均由笔者所在实验室保存。 1.1.2试剂限制性内切酶NotⅠ、EcoRⅠ为TaKaRa公司产品；T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、核酸标准相对分子质量购自TaKaRa公司；蛋白质分子量标准购自MBI公司；蛋白胨和酵母粉购自英国OXOID公司；氨苄青霉素购自Ameresco公司；IPTG购自Merck公司；丙烯酰胺（Acr）及甲叉双丙烯酰胺（Bis）购自Promega公司；四甲基乙二胺（TEMED）购自 BioRad 公司；考马斯亮蓝R-250购自Sanland公司；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Axygen公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂为Sigma公司产品；Goat-Rabbit IgG-HRP购自 Bioworld；其余试剂均为国产分析纯。 1.1.3试验动物本研究所用动物为健康的新西兰大白兔。 1.2试验方法 1.2.1pGEX-4T-1-hAPOA1原核表达质粒的构建根据人源的hAPOA1基因序列（Gene ID：335）设计引物，5′和3′端分别加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。上游引物：5′-CCGGAATTCATGAAAGCTGCGGTGCTGACCTT -3′；下游引物：5′-AAAGCGGCCGCTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT-3′。以hAPOA1的全长cDNA序列为模板进行PCR扩增，反应程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。P···试读结束