微生物学检验之霉菌计数操作规程.pdf

微生物学检验之霉菌计数操作规程 1 范围 本标准规定了烟草及烟草制品微生物学检验的霉菌计数法。 本标准适用于烟草及烟草制品的霉菌计数。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 根据霉菌生理特性，选择适宜于霉菌生长而不适宜于细菌生长的培养基，采用平板菌落 计数法测定样品中霉菌数。 4 设备和材料 4.1 分析天平：感量0.1 g。 4.2 恒温培养箱：28 ºC±1 ºC。 4.3 冰箱：2 ºC～5 ºC。 4.4 拍击式均质器。 4.5 加压蒸汽灭菌器：工作压力可达0.15 MPa。 4.6 超净工作台。 4.7 水浴锅：温度可达45 ºC～65 ºC，控温精度±1 ºC。 4.8 无菌玻璃三角瓶：250 mL、500 mL。 4.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。 4.10 无菌平皿：直径90 mm。 4.11 无菌试管：18 mm×180 mm。 4.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 4.13 无菌均质袋。 4.14 无菌镊子、剪刀等。 5 培养基和试剂 配制培养基和无菌蒸馏水所用水均应符合GB/T 6682 中三级水规格。 5.1 改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基：成分及制法见附录A。 5.2 无菌蒸馏水：蒸馏水分装后，121 ºC加压灭菌20 min。 6 检验程序 霉菌计数的检验程序见图1。 检样 烟草 烟草制品 剪成小块 25 g 样品 均质袋+225 mL 无菌蒸馏水 均质袋置于拍击式均质器中，处理 3 min* 10 倍系列稀释 选择 2~3 个适宜稀释度的样品匀液，各取 1 mL 分别加入无菌平皿内 每皿中速加入约 15 mL 改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基 28 ℃±1 ℃培养 5 d 霉菌菌落计数 报告 *表示：均质速度：2 ；均质力度：标准。每处理30s 后均质袋换一方向，续处理。 图1 霉菌计数的检验程序 7 操作步骤 7.1 样品制备 采样时应避免微生物的污染。样品采集后应尽快检验，否则应将样品置于低温干燥处。 烟草样品：用无菌剪刀将样品剪成小块（约3 cm×3 cm ），充分混合后称取25 g样品置于 无菌均质袋中。 烟草制品（卷烟）样品：称取25 g样品置于无菌均质袋中。 7.2 样品稀释 7.2.1 将225 mL无菌蒸馏水 （5.2 ）加入至具试样的均质袋中，用拍击式均质器拍打3 min，制 成1:10样品匀液。 7.2.2 取1 mL 1:10稀释液（7.2.1 ）注入有9 mL无菌蒸馏水（5.2 ）的试管中，另换一支1 mL无 菌吸管反复吹吸，此液为1:100 样品匀液。 7.2.3 按7.2.2 制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一支1 mL无菌吸管。 7.2.4 根据对样品霉变程度的估计，选择（2～3 ）个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递 增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液于两个无菌平皿内。同时，分别吸取1 mL 无菌蒸馏水（5.2 ）于两个无菌平皿中作空白对照。 7.2.5 快速将约15 mL冷却至4