猪流行性腹泻毒株S基因分离鉴定及序列分析-《江苏农业科学》(2019年11期).docx

龙源版权所有 猪流行性腹泻毒株S基因分离鉴定及序列分析作者：尹国友 王林嵩来源：《江苏农业科学》2019年第11期 摘要：根据NCBI上传的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）[GenBank：JN547228（CH/S）]，设计引物对阳性病料进行鉴定并回收，与pMD18-T构建重组载体并测序。对猪流行性腹泻病毒的基因多样性及序列保守性进行分析，一是以经典毒株为主，包括CV777、KPEDV-9和CH/S株等为代表的G1基因型，另一种是以近几年分离的毒株为主，包括HB3-CH2012、CXHZ-CH2013、HNCZ-CH2013等为代表的G2基因型。基因同源性分析比较结果表明，这4株PEDV之间的序列同源性为97.6%～100.0%，与经典株CV777的同源性为92.7%～92.8%。同源分析显示，PEDV不同毒株间的基因同源性仍高度相似，但PEDV流行毒株已呈现进化分支的趋势。 关键词：猪流行性腹泻病毒;S基因;序列分析 中图分类号：S858.285.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）11-0071-03 猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea，PED）是一种高死亡率的肠道传染病，会在猪群中引起各个年龄段猪暴发急性腹泻，多发于仔猪和胎猪，其临床症状主要以猪水样腹泻、呕吐和脱水为主。1971年，英国首先报道了PEDV的暴发流行[1]，随后在比利时、德国、瑞士、日本、韩国等许多养殖大国出现报道[2-3]。1976年，中国大陆首次报道PED的发生与流行，1984年通过免疫荧光试验证实病原微生物为猪流行性腹泻病毒[4]。20世纪80年代后，我国不断有PED发生，其中26个省（市、自治区）都曾发生。20世纪90年代后期，猪传染性胃肠炎（华毒株）和猪流行性腹泻（CV777）二联灭活苗或弱毒苗，在我国开始大范围使用并取得良好免疫效果[5]。国内外对该病的研究和重视程度均远远不够，我国甚至没有把猪流行性腹泻列为国家动物法定传染病的一、二和三类疫病[6]。自2006年后，以经典毒株CV777基础研制的灭活苗或弱毒苗免疫效果下降，免疫过的猪场还出现多次猪流行性腹泻病的暴发。2010年起，猪流性腹泻病开始在全国大部分的主要养殖区出现，导致初生仔猪死亡率高达90%以上，全国仔猪死亡估计有上千万头[7-8]，给生猪养殖业造成了难以估量的经济损失。 PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属，其中冠状病毒属分为α、β、γ、δ 4个群[9]，猪流行性腹泻属于冠状病毒α群，猪流行性腹泻基因组是单股正链具有感染性的RNA，其基因组大小为28 kb左右，其中S基因编码的S蛋白是一种跨膜糖蛋白，位于病毒表面。S蛋白与细胞受体结合、病毒融合，最重要的是，在诱导中和抗体方面和病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞方面发挥关键作用[10-11]。通过分析比对猪流行性腹泻病毒S基因分离株与经典株之间核苷酸和氨基酸的同源性、抗原表位差异、糖基化位点及跨膜域差异性，以期为预防和控制猪流行性腹泻暴发流行提供理论数据支撑。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 Trizol LS Reagent，购自美国Invitrogen公司产品;pMD18-T载体克隆试剂盒、DL 2000 DNA Marker、rTaq酶、RNA酶抑制剂（HPRI）、dNTP、反转录酶（AMV）、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，均购自生工生物工程（上海）有限公司;BamH Ⅰ及Hind Ⅲ限制性内切酶，均购自宝日医生物技术（北京）有限公司;DH5α大肠杆菌感受态细胞由实验室保存。本研究于2016年在河南城建学院分子生物学实验室完成。 1.2 引物的设计和合成 根据NCBI数据库GenBank中发表的JN547228基因序列，设计并合成S基因测序引物，引物序列见表1。 1.3 模板的制备 取来自发病猪的病变组织细胞匀浆液，按Trizol LS Reagent使用说明，提取病毒RNA，將提取物RNA置于 -20 ℃ 冰箱保存。 1.4 RT-PCR 将设计好的下游引物1.0 μL，0.4 μL Rnase-Inhibitor，5.0 μL dNTP，4.0 μL 5×AMV Buffer，1.0 μL AMV，加入 10.0 μL RNA，42 ℃水浴1～2 h，即得cDNA模板，-20 ℃保存备用。 1.5 目的片段S基因的扩增 取cDNA产物1.0 μL作为模板进行PCR扩增，扩增体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，rTa