进境菠菜种子携带菠菜潜隐病毒的检测与鉴定 -《江苏农业科学》(2020年9期).docx

龙源版权所有 进境菠菜种子携带菠菜潜隐病毒的检测与鉴定 作者：冯黎霞 何瑞芳 左然玲 来源：《江苏农业科学》2020年第09期 关键词：菠菜潜隐病毒;RT-PCR;菠菜;检测 菠菜（Spinacia oleracea L.）是中国普遍栽培的蔬菜之一。菠菜潜隐病毒（Spinach latent virus，SpLV）是菠菜上重要的种传病毒病害，曾用名为GE36，属雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）。SpLV基因组结构为单链正义五分体RNA，必需有3个大的组分（RNA1、RNA2、RNA3）及1～2个小的组分（RNA4、RNA5）或外壳蛋白一起才能完成侵染过程，主要侵染菠菜、番茄、藜麦、甜菜、鸡冠花、黄瓜、克利夫兰烟、黏毛烟、黄花烟、菜豆等，SpLV存活期长，至少可以在菠菜、藜麦种子中存活5年，远距离传播主要依靠种子[1-2]。SpLV目前主要分布在丹麦、芬兰、瑞典、挪威、南斯拉夫、新西兰、克罗地亚、美国、日本等国家或地区[3-6]，我国没有分布，也没有截获的任何报道。 本研究以进境的菠菜种子为材料，应用一步法逆转录PCR（RT-PCR）技术对SpLV进行检测鉴定。 1 材料与方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 材料 受检材料为2019年3月广州海关检验检疫技术中心植检室接收的进境的菠菜种子。 1.1.2 试剂 核酸提取试剂TRIzol为Invitrogen公司产品;RT-PCR一步法试剂盒（PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit）、DNA Marker 2000购自大连TaKaRa公司。 1.1.3 引物 SpLV RNA1组分引物SpLV-RNA1-F/R序列：5′-TGTGGATTGGTGGTTGGA-3′，5′-CTTGCTTGAGGAGAGATGTTG-3′; RNA2组分引物SpLV-RNA2-F/R序列：5′-GAACCACCGAAACCGAAA-3′，5′-CCACCTCAACACCAGTCATAG-3′;RNA3组分引物SpLV-RNA3-F/R序列：5′-GCCTTCATCTTTGCCTTTG-3′，5′-CATTTCATCTGCGGTGGT-3′;预期扩增产物大小分别为722、436、213 bp[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2 方法 1.2.1 样品RNA的提取 随机取样并称取50 g菠菜种子，研磨成粉末状，称取0.1 g移入灭菌的 2 mL 离心管中，加入1 mL的TRIzol试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3 min;4 ℃、12 000 g离心10 min，取上清;加入200 μL三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静置3 min;4 ℃、12 000 g离心10 min，取上层水相;加等体积的异丙醇，颠倒混匀;4 ℃、12 000 g离心10 min，弃上清;加1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃、7 500 g离心 5 min，弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后，溶于 50 μL 无RNA酶的ddH2O，-20 ℃保存备用。 1.2.2 RT-PCR扩增 利用一步法RT-PCR试剂盒，针对SpLV的3个不同组分进行RT-PCR一步法检测，扩增体系如下：PrimeScript One Step Buffer 25 μL，上下游引物各（20 μmol/L）1 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL，最后加RNase Free H2O至总体积为50 μL。反应参数如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃10 min。 1.2.3 PCR产物的检测 RT-PCR反应结束后，取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果。PCR产物由广州天一辉远基因科技有限公司纯化并测序。 2 结果与···试读结束