斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株同源重复区hr1的结构功能分析-《江苏农业科学》(2019年21期).docx

龙源版权所有 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株同源重复区hr1的结构功能分析作者：刘惠芬 衣葵花 刘文光 董亚茹 张志芳 李云芝 王安皆来源：《江苏农业科学》2019年第21期 摘要：斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus Ⅱ，SpltNPVⅡ）基因组DNA同源重复区hr1大小为1 746 bp，含有6个64 bp不完全回文序列、4个正向重复序列以及7个与病毒基因组DNA复制相关的基序。瞬时表达分析结果表明，SpltNPVⅡhr1在感染野生型家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）和苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）的BmN和Sf21细胞中均具有增强早期基因ie1启动子活性的功能，增强效率分别为30、350倍;实时荧光定量PCR结果显示，hr1在BmN和Sf21细胞中具有基因组DNA复制起始原点的功能，拷贝数分别为（8.46×104±6.13×103）、（592×106±2.95×105）copies/μg DNA。研究证明，SpltNPVⅡ hr1在异源细胞BmN和Sf21中具有复制起始原点和增强子的双功能作用。 关键词：斜纹夜蛾;核型多角体病毒;同源重复区;hr1 中图分类号： S433.4;Q78文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）21-0100-03 收稿日期：2019-08-09 基金项目：山东省自然科学基金（编号：ZR2017BC080）;山东省现代农业产业技术体系蚕桑产业创新团队建设项目（编号：SDAIT-18-03）。 作者简介：刘惠芬（1982—），女，山东滕州人，博士，助理研究员，主要从事昆虫病毒学研究。Tel：（0535）6527628;E-mail：liuhuifen77@163.com。 通信作者：李云芝，研究员，主要从事家蚕病理研究，Tel：（0535）6527628，E-mail：yzli888@163.com;王安皆，副研究员，主要从事家蚕病理研究，Tel：（0535）6527628，E-mail：wangaj77@126.com。 杆状病毒是一类环状双链DNA病毒，其基因组大小为80～180 kb。在杆状病毒的发育循环中，DNA复制是其生命周期中最重要的一环，也是病毒增殖周期最重要的事件[1]。DNA复制原点是最为重要的顺式作用元件，对DNA的复制极为重要。研究发现，杆状病毒DNA复制原点有2种类型，分别为同源重复区（homologous repeat regions，hr）和非同源重复区起始位点（non-hr）[2-4]。其中，hr存在于大多数杆状病毒基因组中，是目前研究较多的类型。 hr作为核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus，NPV）DNA复制原点已在众多杆状病毒中得到证实[5-9]。苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）基因组含有8个复制原点，包括7个hr和1个HindⅢ-K片段，研究发现7个AcMNPVhr均具有复制原点功能[5]。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）基因组含有8个复制原点，其中hr3和hr5不仅在宿主细胞中具有复制原点功能，在AcMNPV感染的非宿主Sf21細胞中亦可得到复制，而且hr5在AcMNPV感染的Sf21细胞中的复制功能比在BmNPV感染的BmN细胞中高一些[6，10-11]，表明与AcMNPV复制有关的因子亦能作用于BmNPV的hrs。hr除具有复制原点的功能外，还具有早期基因表达增强子的功能。BmNPV ZJ-8株 hr3具有增强ie1和hel基因启动子活性的功能，其增强转录活性分别高达2 400、7 000倍左右，即使仅含有hr3中1个典型完整的回文序列，其增强能力也高达79倍[12-13]。在Sf9细胞中，AcMNPVhr1序列除具有复制原点的功能外，还能够增强多角体启动子和果蝇hsp70基因启动子的转录活性[14]。 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus Ⅱ，SpltNPVⅡ）基因组DNA含有7个hrs，前期研究证实7个hrs在宿主细胞Spli221中具有复制原点和增强子的功能[7]，本研究拟对SpltNPVⅡhr1进行结构分析，并采用脂质体介导的质粒转染法与实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）