江苏地区1株锦鲤疱疹病毒的鉴定-《江苏农业科学》(2019年12期).docx

龙源版权所有 江苏地区1株锦鲤疱疹病毒的鉴定作者：袁锐 方苹 倪金俤来源：《江苏农业科学》2019年第12期 摘要：对我国江苏地区养殖锦鲤暴发性鲤疱疹病毒病（koiherpes virus disease，简称KHVD）的病原进行鉴定。2018年5月，江苏省一锦鲤养殖场暴发不明原因传染疾病，病鱼肝、脾、肾脏中未分离到细菌。透射电镜观察发现大量球状病毒粒子。提取自然发病鱼的鳃、肾、脾、肝组织DNA作为模板进行PCR检测，结果显示为阳性。Blast比对结果显示，扩增序列与锦鲤疮疹病毒（koi herpesvirus，简称KHV）胸苷激酶（thymidine kinase，简称TK）基因和KHV DNA聚合酶（SPH）基因核苷酸序列同源性为99%。对病毒株的TK基因全长序列进行系统发育分析，证实该毒株属于KHV亚洲型毒株。 关键词：锦鲤;锦鲤疱疹病毒;病毒鉴定;系统进化分析 中图分类号：S941.41+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）12-0200-04 鲤疱疹病毒病（koiherpes virus disease，简称KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，简称KHV）引起锦鲤和鲤鱼及其普通变种的一种急性、接触性传染病，该病被我国农业部列为二类动物疫病，对鲤鱼和锦鲤的养殖危害极大，致死率高达80%～100%[1～3]。其病原KHV是双链DNA病毒，基因组全长为295 kb[4]，编码164个开放阅读框，KHV有多种基因型，目前已完成全基因组测序的分离株有日本株（KHV-J）、美国株（KHV-U）、以色列株（KHV-I）以及在我国分离的KHV-GZ11，其中，KHV-U、KHV-I和KHV-GZ11的相似性较高[4-5]。目前，我国国内报道并成功分离的KHV毒株有辽宁株（KHV-cj）、广州株（KHV-GZ1301）、黑龙江株（KHV-hlj）等[6-8]。现有研究表明，KHV是一种具有高传染性、高发病率和高死亡率的病毒性疾病，可感染任何年龄的锦鲤与鲤鱼，其典型临床症状是行动迟缓、食欲不振、体表尤其是皮肤和鳍基部出现出血症状，严重者眼球凹陷、鳃苍白并伴有中度至严重的坏死，感染后7～10 d开始出现死亡[9-11]。由于KHVD流行范围广，危害大，已经引起我国及世界多个国家的高度重视[12]。 2018年5月，江苏省苏州地区一锦鲤养殖场发生大面积死亡，发病鱼体表黏液明显增多，眼球凹陷，全身体表多处出血，尤其是鳍基部严重出血，剖检后可见病鱼脾脏、肾脏明显肿大，然而从内脏器官中未能分离检测到细菌，镜检也未见寄生虫。根据病鱼的临床特征及发病时间初步判断该病由KHV引起，为进一步验证导致锦鲤大量死亡的原因，根据我国水产行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒》设计检测引物进行病毒PCR检测，对病灶部位的电镜观察显示。根据胸苷激酶（thymidine kinase，简称TK）基因全长序列建立系统发育树，研究其株型。本研究首次报道KHV在我国华东地区暴发流行。 1 材料与方法 1.1 病样的采集 患病鱼于2018年5月采自江苏省某观赏鱼养殖场，体长50 cm左右，充氧打包运输至实验室。 1.2 主要试剂 病毒DNA提取试剂盒、脑心浸液培养基（BHI）购自北京陆桥生物技术有限公司;PCR Mix预混液购自TaKaRa公司;戊二醛等试剂均为国产分析纯。 1.3 细菌学检查 对病鱼进行解剖观察，同时在无菌操作条件下，从肝脏、脾脏、肾脏取样进行BHI平板、血平板划线分离细菌，28 ℃培养24～48 h，观察病菌生长状况，待菌落形成后进行菌落纯化和鉴定。 1.4 电镜观察 以去离子水配制2.5%的戊二醛固定液，取鳃、肾、肝、脾组织切成薄片，浸泡于戊二醛固定液中固定，在用透射电镜观察前，将组织取出切成0.5 cm×0.5 cm大小的小块，用透射电子显微镜观察并拍照。 1.5 PCR鉴定 病鱼的组织DNA提取按照病毒DNA提取试剂盒的说明进行操作。PCR检测所用引物及检测方法参照我国水产行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分：锦鲤疱疹病毒》进行。引物由TaKaRa公司合成，引物序列见表1，TK基因的扩增体系为 50 μL，反应体系包括25 μL Mix预混液，2.5 μL DNA模板，引物各0.5 μL（浓度为 100 μmol/L），21.5 μL ddH2O，扩增条件：94 ℃预变性5 min;95 ℃变性1 min，51 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，40个循环;72 ℃ 10 min，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，预期得到约409 bp的PCR产物。SPH基因的扩增体系为