砂生槐根瘤内生细菌多样性及其促生潜力研究-《江苏农业科学》(2019年12期).docx

龙源版权所有 砂生槐根瘤内生细菌多样性及其促生潜力研究作者：何建清 张格杰 赵伟进来源：《江苏农业科学》2019年第12期 摘要：以珍稀植物砂生槐为材料，对该植物根瘤内生细菌种群组成及其促生潜力进行研究，为砂生槐在荒漠化地区生态恢复与重建中的应用提供理论依据。采用YMA培养基通过平板涂布分离法分离内生细菌，通过16S rDNA序列同源性分析其遗传多样性，采用溶磷圈和钼锑抗比色法测定溶磷能力，Salkowski比色法测定IAA分泌量，微量凯氏定氮法测定固氮量。结果表明，从砂生槐根瘤中分离到19株代表性内生细菌，分别属于芽孢杆菌属（Bacillus）、解糖假苍白杆菌（Pseudochrobactrum）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）和普罗威登斯菌属（Providencia）等5个属，其中芽孢杆菌属为优势菌属。在19株供试细菌中，7株具有良好的溶解无机磷能力，溶磷量达到 100 mg/L 以上;6株菌株具有良好的溶解有机磷能力，溶磷量達到42 mg/L以上;5株菌株具有良好的固氮能力，固定氮量达 44 mg/L 以上;3株菌株具有良好的IAA分泌能力，IAA分泌量达45 μg/mL以上。利用种子发芽指标测定高溶磷菌株的促生能力，其中菌株R24能明显提高砂生槐种子的萌发率。综上，西藏砂生槐根瘤内生细菌遗传多样性丰富，且具有良好促生能力，是重要的生物资源。 关键词：砂生槐;根瘤;内生细菌;16S rDNA;促生能力 中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）12-0297-05 在研究根瘤菌与豆科植物共生关系的过程中，人们发现根瘤中同时定居着许多与根瘤菌不同的内生菌，这些非共生细菌生活在根瘤中，但不引起植物产生明显的病害，为根瘤内生细菌[1-2]。植物内生细菌不仅将植物作为其栖息场所，而且对宿主植物有促生、防病、内生联合固氮等广泛的生物学作用[3-6]，根瘤内生细菌也有类似的作用[7-9]。植物内生细菌因具有多方面的生物学和生态学功能，成为潜力巨大、尚待开发的微生物新资源，受到广泛重视[10-11]。相对于植物其他组织部位的内生细菌而言，关于根瘤内生细菌的研究相对较少。 砂生槐（Sophora moorcroftiana），别称西藏狼牙刺、刺柴、金雀花等，藏语名吉瓦，为豆科槐属多年生矮灌木，是青藏高原特有种[12-13]。砂生槐灌丛主要分布在雅鲁藏布江流域中段的宽谷、两侧低山及拉萨河、年楚河等主要支流的宽谷内。作为典型的河谷灌丛，砂生槐具有良好的防风固沙、涵养水源等重要生态作用[14-15]。目前关于砂生槐的研究主要集中在种群和群落结构、繁殖特性、固沙特性和物种多样性等方面[16-18]，迄今未见关于砂生槐根瘤内生细菌及其促生性的研究报道。鉴于此，本研究以西藏砂生槐根瘤为研究材料，探讨砂生槐根瘤内生细菌资源多样性及其促生潜力，为其在西藏荒漠化地区生态恢复与重建中的应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 根瘤的采集 2017年5—7月分别从西藏米林县、朗县、加查县、林周县、白朗县、拉萨市、日喀则市、贡嘎县、扎囊县等地采集盛花期和结荚期砂生槐根瘤样品。将采集的结瘤砂生槐根部装入无菌自封袋中，并置于装有冰袋的塑料泡沫箱内，带回实验室备用。 1.2 培养基及试剂 本研究所用的培养基参照文献[19]配制，其中甘露醇酵母汁（YMA）培养基用于根瘤内生细菌的分离与纯化;营养琼脂（NA）培养基用于细菌的活化培养与保存;阿须贝（Ashby）无氮培养基用于固氮菌的分离及固氮能力的测定;磷酸三钙无机磷（PKO）培养基和蒙金娜有机磷（PVK）培养基用于溶磷菌的分离及溶磷量的测定;无色氨酸King培养基[20]用于生长素分泌量的测定。S2比色液[21]。 1.3 砂生槐根瘤内生细菌的分离与纯化 砂生槐根瘤内生细菌的分离与纯化参照文献[22]。首先用自来水将附着于砂生槐根瘤上的泥土冲洗干净，放入75%乙醇中浸泡3 min，取出放入0.1%氯化汞溶液中进行表面灭菌3 min，再用无菌水洗涤5～6次，并将最后1次洗液涂布于YMA培养基上，置于28 ℃培养箱中培养2 d，若无菌落生成则表明根瘤表面消毒合格。将表面消毒合格的根瘤依次装入盛有 0.5 mL 0.85% NaCl的离心管中，用已灭菌枪头将其压碎。吸取0.5 mL根瘤汁液均匀涂布于YMA培养基上，将培养皿倒置，28 ℃培养3～7 d。用划线法进行纯化，并将纯化后的细菌转接于NA斜面培养基上，4 ℃保存备用。 1.4 砂生槐根瘤内生细菌遗传多样性分析 用NA液体培养基将菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，按照黄宝灵等的方法[23]提取菌株总DNA，采用16S rDNA通用引物27F：5′-AG