聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

第二十九页，共四十二页，2022年，8月28日 实验过程 凝胶制备 样品处理与加样 电泳 剥胶与固定 染色与脱色 安装电泳槽 第三十页，共四十二页，2022年，8月28日 第一页，共四十二页，2022年，8月28日 1、作用 分离蛋白质、核酸 2、概念 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 第二页，共四十二页，2022年，8月28日 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。 电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致） 3、原理 第三页，共四十二页，2022年，8月28日 （1）丙烯酰胺结构式 第四页，共四十二页，2022年，8月28日 （2）亚甲双丙烯酰胺 第五页，共四十二页，2022年，8月28日 第六页，共四十二页，2022年，8月28日 PAGE 的 聚 合 需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。 （1）化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。 AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。 第七页，共四十二页，2022年，8月28日 注意： ?TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 ?分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 ?升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合 第八页，共四十二页，2022年，8月28日 （2）光聚合：核黄素-TEMED系统 核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意： 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。 第九页，共四十二页，2022年，8月28日 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native） 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） （根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质） （根据亚基分子量分离蛋白质） 第十页，共四十二页，2022年，8月28日 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 第十一页，共四十二页，2022年，8月28日 概述 1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。 第十二页，共四十二页，2022年，8月28日 基本原理 1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS （十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS) 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 第十三页，共四十二页，2022年，8月28日 (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。 第十四页，共四十二页，2022年，8月28日 实验原理 第十五页，共四十二页，2022年，8月28日 第十六页，共四十二页，2022年，8月28日 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 第十七页，共四十二页，2022年，8月28日 SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚成组成它们的多肽链 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。 第十八页，共四十二页，2022年，8月28日 蛋白质-SDS胶束的特点： （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 胶束在SDS系统中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基