3年经验总结！新冠检测实验室，核酸气溶胶污染避坑指南（强烈推荐）！.docxVIP

PAGE2 / NUMPAGES2 3年经验总结！新冠检测实验室，核酸气溶胶污染避坑指南（强烈推荐）！ 一、核酸气溶胶污染的来源 01 阳性质控品 较常见，发生概率在40%~60%之间；以重组质粒作为阳性质控品，发生污染的概率更大；以构建的假病毒或重组病毒作为阳性质控品，参与核酸提取的过程中，也容易发生气溶胶污染；在试剂的配制过程中，接触了污染的容器、移液器、枪头、溶液，核酸气溶胶等，导致试剂被污染。笔者认为，这是目前实验室引起的核酸污染最主要原因！ 02 PCR扩增产物 尤其是是第一代PCR技术，发生概率在60%以上；PCR产物经反复多次的扩增，其复制量远远超过PCR的检测极限。 一个气溶胶所包含的拷贝数可以在104~106copies，因此即使是极微量的污染也足以造成实验结果假阳性。 但是，在采用了UNG/UDG防污染的PCR产品中，扩增产物引起的污染概率降至10%左右。 PCR扩增管的密封性是预防扩增产物污染的关键。如果密封不严，扩增完成后有蒸发现象，液面不整齐，或者扩增过程中有“炸管”声音。 03 待测强阳性样品 发生概率在10%~30%之间。放置样品的容器被污染或由于容器密封不严导致样品与外界接触被污染;待提取样本中含有强阳性样本，其提取的样品中含有高浓度的阳性核酸，形成气溶胶造成污染。气溶胶是由空气与液体表面摩擦而产生的。开盖、晃动、加样器的反复抽吸等开放式操作，形成核酸气溶胶从而导致核酸污染。以上核酸污染来源，均可形成气溶胶扩散至空气中，或直接吸附到物体表面。因此，应尤其重视由气溶胶导致污染的问题。重度污染假阳性的ct值可在24左右，中度污染ct值在30左右；轻度污染ct值在33左右。从核酸污染的分布来看主要在2个地方：1、空气中的核酸气溶胶污染物：弥散到实验室各个角落，比较棘手；2、物表的核酸污染物：移液器、离心机、核酸提取仪、传递窗、PCR仪、拆开的试剂盒、枪头盒、打开的耗材等表面。 二、造成核酸污染的原因 1.硬件 严格的PCR实验室应有标准的正负压系统及四分区（或三分区），实验室应按照生物安全二级实验室及PCR实验室设计基本要求来建设。可参考的标准为《GB50346-2011建设标准生物安全实验室建筑技术规范》及卫健委下发的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。标准实验室如下图： 医疗口的实验室大多符合要求，在科研口和农业口的实验室应重视实验室的规范性建设！软件配置应按照卫健委相关技术文件规定，人员配置应专区专人，人员不可不同分区混用，物流、人流、气流做到单向流动！临床上，门诊的新冠快检PCR实验室（或免提取方法）多半不规范。没有严格按照标准PCR实验室建设，更加容易发生污染。三分区（或二分区）、缓冲间、正负压、人员配置2人以上，这些基本要求没有达到，更加容易发生气溶胶污染。 2.生物安全柜 现有技术指导原则，只要求了选择BSL-Ⅱ级生物安全柜，但并未规定具体型号。从临床经验来看，只有B2型生物安全柜可以用于加核酸模板。A1型、A2型、B1型，循环风很容易造成核酸气溶胶的形成，从而造成污染，且污染很难清除。B2型为全排放，无循环风，可以用于加核酸模板。 3.常见的消毒措施并不能有效降解核酸 紫外灯能杀灭病毒，但是《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》指出，短片段的基因核酸对紫外线损伤不敏感。常规消毒剂如酒精、碘化物、戊二醛类、季铵盐等虽然能杀菌，但是不能降解核酸，或降解效率较差。尤其是酒精，它其实是核酸提取试剂中的一个组分，对核酸没有任何降解作用。已知的消毒剂中，次氯酸盐类消毒剂可以一定程度的降解核酸，但是腐蚀性强，不能处理精密仪器及金属制品，容易腐蚀移液器吸杆影响tip头气密性。 4.那些容易忽视的操作细节 吸取阳性对照（质粒）没有遵循“慢吸快打”的原则（这个需要练习形成“肌肉记忆”），新手往往是“快吸快打”，造成阳性样品污染枪头，或者在生物安全柜循环风的影响下，造成气溶胶飞溅，污染加样区域。应使用带有滤芯的枪头。 带滤芯枪头 4.2加样区没有放置台面垃圾桶：应把加完样的tip枪头，丢入含有次氯酸溶液的加盖垃圾桶中。因为次氯酸容易挥发，因此应每天都要更换含氯消毒液！ 桌面垃圾桶（利器盒） 5.污染高风险区域 在笔者的临床实践中，发现以下区域存在阳性污染的概率更大： 污染风险排行榜：2区＞3区＞1区；生物安全柜＞核酸提取仪＞移液器＞PCR扩增仪（PCR管密封性）＞离心机；阳性质控品＞强阳性样本＞PCR扩增产物（无UNG技术）＞PCR扩增产物（UNG技术），PCR管密封性是扩增产物是否引起污染的关键。如同，幸福的家庭都一样，不幸的家庭各有各的不幸。同理，规范的实验室都一样，污染的实验室各有各染情况。以上数据仅供参考。 三、核酸污染的解决方案 NO1.复盘："人、机、料、法、环“首先针对上述产生气