利用CIRCLE-seq检测CRISPR_Cas9在牛胎儿成纤维细胞中脱靶效应的研究.pdf

摘 要 摘要 II CRISPR clustered,regularly interspaced,short 细菌获得性免疫系统中 型 （ palindromicrepeat;CRISPR）系统的 CRISPR/Cas9 核酸酶做为第三代基因编辑技术近 年来被广泛应用。CRISPR/Cas9 技术主要依靠单向导RNA（single-guideRNA,sgRNA） 与基因组序列的碱基互补配对实现精准基因编辑，但是该识别模块对于碱基的错配具 有一定的容忍度，从而导致脱靶效应 （off-target effects）。脱靶效应的存在严重制约着 该技术的应用，尤其在转基因动物生产方面会引起基因组的插入和缺失 （insert and deletes,indels）、癌症的发生和转基因动物生产效率低下等问题。因此，对CRISPR/Cas9 技术脱靶效应的检测和评估也成为研究热点。本研究首先使用在线预测工具ZiFiT 和 Cas-OFFinder 在牛ROSA 26基因座中初步筛选出全基因组范围内潜在脱靶位点最少 的sgRNAs序列，然后利用CIRCLE-seq 的方法对不同的sgRNAs在对应位点的脱靶 活性进行检测，以期全方位评估CRISPR/Cas9技术在转基因牛培育过程中的脱靶效应。 主要研究内容如下： 1. ROSA 26 Cas-OFFinder 牛 基因座内潜在打靶位点体外切割效率检测。利用 在牛 ROSA 26基因座上筛选出11、34和45号位点，并设计对应的sgRNAs。将Cas9-sgRNAs 复合物与体外扩增的靶位点序列共孵育，通过凝胶电泳成像与灰度分析检测不同靶位 11 点的切割效率。结果表明各打靶位点上的切割效率具有明显差异，其中 号位点切 割效率最高，其次是34 号位点，45 号位点无明显的切割作用。 2.牛基因组片段化与环化及CRISPR/Cas9体外切割反应。为了保证基因组片段化 效果，本研究采用微球菌核酸酶、接触式超声仪和非接触式超声仪对基因组进行片段 化处理，并对比了这三种途径的打断效率和重复性。结果表明在超声循环数固定为9 次的条件下，非接触式超声仪的打断效率和重复性最高，可以将最佳浓度的牛基因组 120ng/µL 300~500bp DNA DNA 样品 （ ）处理为 片段。随后通过连接反应为片段化 添加具有回文序列的接头，经由系列酶促反应使其环化。最后将环化基因组片段与 sgRNAs共孵育，并利用PCR 扩增与Sanger 测序鉴定靶位点环化及切割效果，最终 得到了可用于后续自建库的样品。 3.CIRCLE-seq 自建库及测序结果基因打靶验证。通过设置Adapter 和Input DNA 的摩尔比梯度，探究最佳的自建库反应体系。结果表明对于100ng~500ng 的Input DNA Adapter:Input DNA 100:1 Qubit ， 摩尔比为 时可达到最好的建库效果。通过使用 荧光定量和qPCR定量相结合的方式可以及时监测测序接头连接反应和文库扩增反应 的进行。基于CIRCLE-seq 结果，通过基因打靶阳性克隆筛选与统计，验证了11号位 I 西北农林科技大学硕士学位论文 点实际打靶效率最高，证明该方法可用于建立转基因牛生产中脱靶效应的评估标准。 综上所述，本研究通过对CIRCLE-seq 技术反应体系进行了优化，该方法首次被 应用于牛的ROSA 26基因座上的脱靶效应检测