重组dna技术详细概括.ppt

重组DNA技术 中心法则 编码链，有意义链， Crick 链 转录 翻译 重组DNA技术的基本步骤 基因克隆的载体 载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们带入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。一种理想的载体至少满足以下几个条件： （1）大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于在原核系统中的扩增； （2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便在真核细胞内的自主复制； （3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点，以方便各种克隆片段的插入和建立DNA文库； （4）带有抗生素抗性基因或其它选择性标记，有利于克隆的筛选和鉴别； 目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。 pUC18/19质粒的基本结构 λ噬菌体载体的构建、重组和包装 细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入 酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入 将外源基因或序列导入载体的工具 将外源基因或序列导入到载体需要特殊的工具酶，其中以限制性内切酶（RE）和连接酶最为重要，此外，有时还需要DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸酶等。 限制性内切酶 限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异性的DNA内切酶，它们识别双链DNA分子内部特殊的碱基序列（通常为4bp~6 bp的回文序列），切开DNA的两条链，产生特定的末端。 限制性内切酶的命名是按照酶的来源菌的属名和种名而定，由属名的第一个字母和种名的头两个字母组成的三个斜体字母缩写而成。如有菌株名，再加上一个字母，其后再按发现的次序添上罗马数字。例如，第一种限制性内切酶是在大肠杆菌RY13（E. coli RY13）被发现的，按照上述规则，它被命名为EcoRI。 已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2）Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA技术中提到的限制性内切酶都属于此类。 II类限制性内切酶的三种切割方式 常见的几种RE识别的碱基序列和切点性质 不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火 宿主细胞 宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但最为常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地贪夜蛾的培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。 大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造过的昆虫杆状病毒载体。 将重组DNA引入到宿主细胞的途径 转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移 重组体的选择和筛选 直接筛选 1. 根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 2. 根据营养需要进行筛选 3. 根据噬菌斑类型进行筛选 4. 蓝白斑选择 间接筛选 1. 核酸杂交法 2. PCR法 3. 免疫化学 4. 受体/配体的结合性质 5. Southwestern/Northwestern 6. DNA限制性内切酶图谱分析 7. DNA序列分析 蓝白筛选法图解 基因克隆的详细步骤 获得外源DNA序列和目的基因； 将目的基因与载体相连； 将重组体导入特定的宿主细胞； 目的基因序列克隆的筛选与鉴定。 获取目的基因的手段 人工合成 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆载体中释放出来 反转录 PCR 目的基因与载体的连接 将外源序列或目的基因插入载体，主要是靠DNA连接酶和其它工具酶的配合使用。根据末端的性质，它们的连接方式主要有三种：（1）载体和目的基因具有相同的粘性末端；（2）载体和目的基因均为平端；（3）载体和目的基因各有一个粘性末端和一个平端。选择哪一种连接方式主要取决于载体的性质（特别是MCS的性质）和目的基因的来源。 基因克隆的应用 文库建立 序列分析 表达外源蛋白 制备转基因动物和植物 基因治疗 基因敲除 寻找未知基因。 文库的建立 基因克隆中的文库是指克隆到某种载体上能