第二章-蛋白质结构(新).ppt

蛋白质的分析法-蛋白质的浓缩、干燥和保存 1）样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。 （1）减压加温蒸发浓缩 （2）空气流动蒸发浓缩 （3）冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中 （4）吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。 （5）超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法。 蛋白质的分析法-蛋白质的浓缩、干燥和保存 2）干燥 　　生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。 冷冻干燥：将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。 真空干燥：是一种将物料置于真空负压条件下，使水的沸点降低，在真空负压条件下可使水的沸点降到20℃甚至零度以下开始蒸发。 蛋白质的分析法-蛋白质的浓缩、干燥和保存 3）贮存 生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可。 液态贮藏时应注意以下几点。 （1）样品不能太稀，样品太稀易使生物大分子变性。 （2）一般需加入防腐剂和稳定剂。 （3）贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 1、Western-Blotting (Immunoblotting 免疫印迹） 蛋白质印迹法(免疫印迹),基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 可以对混合物中一种或多种特异蛋白进行定性和半定量检测。 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 Western-blot 过程示意图 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 Western Blotting 的操作步骤 （1）、Sample Preparation （2）、Gel electrophoresis Stacking gel (5%)PH=6.8 Separation gel (>5%)PH=8.8 Electrophoretic transfer nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 （3）蛋白质的电转移（Nitrocellulose transfer） Prevent non-specific protein interactions between the membrane and the antibody protein. 一般使用去脂奶粉（0.5%) 或血清白蛋白。 （4）Blocking 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 （5）靶蛋白与第一抗体反应（Primary antibody） Western Blot中检测蛋白质的探针是抗体。 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 （6）与第二抗体反应 (Secondary antibody) 二抗是针对一抗的免疫球蛋白， 可用同位素和非同位素标记。如碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP), 或辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP)。 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 (7) 显色（development) 碱性磷酸酶(AKP)催化 BCIP （ 5-溴-4-氯-3吲哚磷酸） NBT （氮蓝四唑） 辣根过氧化物酶（HRP) DAB (3,3’-二氨基联苯胺） H2O2 棕色条带 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 2、免疫共沉淀（Co-immunopreci