分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性.doc

蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。 【实验原理】 蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。 UDPG+果糖---蔗糖+UDP 这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。 蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖： UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+ 6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。实际上最近有证据证明SPS和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。 一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。 果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。 【实验材料】 植物茎 【仪器设备及设备】 冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱 【试剂药品】 1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。 2.透析缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含2.5mmol/LMgCl2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。 3.酶反应液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果糖,2mmol/LEDTA-Na2, 5mmol/L 醋酸镁，5mmol/LDTT。 4.10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为10mol/LUDPG,随配随用。 5.2mol/LNaOH 6.30%HCl 7.0.1%间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml95%乙醇中，棕色瓶保存。 8.1mg/ml蔗糖标准液 【方法步骤】 1.酶液制备：称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨提取，2度下10000转离心20分钟，上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4度透析过夜，期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml备用。 2.蔗糖合成酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1mlUDPG和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml,于30度水浴中反应10分钟后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。 3.蔗糖含量测定：往各反应试管中加入2mol/LnaOH 0.1ml,沸水浴10min后，冷却至室温。加30%HCl3.5ml,0.1%间苯二酚1ml，摇匀后于80度保温10min,冷却后480nm处比色，测定蔗糖生成的量。 4.蔗糖磷酸合成酶反应：在酶反应液中用10mol/L果糖-6-磷酸代替果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法测定。 5.标准曲线制作：取7支10ml具塞试管，并按下表加入各种试剂，按上述步骤3反应并测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横坐标，绘制标准曲线，以计算反应中蔗糖形成的数量。 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 1mg/ml蔗糖标准液（ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蔗糖含量（mg） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 A480 6.结果计算：蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖/(g*FW*L) 酶活力（mg蔗糖/(g*FW*L)）=C*Vt*n/(FW*t*Vs) 式中：C是从标准曲线查得的蔗糖量（mg）；FW是样品鲜重（g）;t是反应时间（h）；Vt是提取酶液总体积（ml）；Vs是测定时取用酶液体积（ml）；n是提取液测定中的稀释倍数。 【注意事项】透析袋不可装满，以防止吸水涨破。