基因专题基因克隆.ppt

基因克隆示意图 　 II型限制性内切酶的作用特点? 识别序列４～６个碱基，4个核苷酸序列，则每４４（２５６）个碱基出现一个靶序列；6个核苷酸序列出现的间隔是4kb。 回文结构（palindrome） 三种不同的切口：平末(blunt end) 端、５’－突出粘性末端(cohensive end or stick ) 和３’－突出粘性末端 二、DNA聚合酶(一) 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 作用特点：是MW=109KD的单条多肽链组成的多功能酶， 具有3种酶的活性： 5′→3′DNA聚合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA的3′-OH末端，使DNA链从5′→3′延伸 3′→5′外切酶活性：能从游离的3′ -OH端降解双链或单链DNA成为单核苷酸，但对双链DNA的3′→5′外切酶活性可被5′→3′聚合酶活性所抑制 5′→3′外切酶活性：能从游离的5′-末端降解双链DNA成为单核苷酸 主要用途: 催化DNA 切口平移反应，制备高比活探针；DNA末端标记（Klenow片段） （二）Klenow 片段：应用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以去除其5′→3′外切酶的活性所得到的片段称为Klenow片段。分子量76kD。 主要应用于DNA测序、合成cDNA第二链，及双链DNA3′端标记 （三）Taq DNA聚合酶 耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，MW=65kD，最适温度75~800C，主要应用于聚合酶链反应（PCR）中对DNA分子的特定序列进行体外扩增 四、反转录酶 亦称依赖于RNA的DNA聚合酶（RDDP) 催化以RNA为模板的DNA聚合反应，以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA (com -plementary DNA)。主要用于cDNA文库的构建。 3′→5′外切酶活性（又称RNA酶H活性），特异性降解RNA-DNA杂交分子中的RNA部分 六、T4多核苷酸激酶：寡核苷酸探针标记；用于连接反应，使缺 少５’端磷酸的DNA片段合成接头磷酸化 质粒的基本特性 1、质粒DNA分子特性 2、质粒的复制和遗传。不同质粒在细菌内的复制方式不同，分为严密型和松弛型。根据质粒是否带有tra基因，可分为结合型和非结合型。 3、质粒载体的条件。能独立复制，具有遗传标志，无流动基因，分子量尽可能小，具有一个或多个限内酶的单一酶切位点。 常用的质粒载体 1、pBR322质粒是由大肠杆菌质粒DNA人工构建的dsDNA克隆载体，长4.36kb，含有一个复制起始点，一个Tetr和Ampr 在两个抗药性基因内有几个限内酶单一酶切位点。可用双抗菌素对照实验筛选。 2、pUC系列是由pBR322质粒与M13噬菌体重组构建的dsDNA质粒克隆载体，长2.67kb ，特点是有LacZ基因的片段（LacZ ’），编码?半乳糖苷酶?-端?-肽段，IPTG可诱导此?-肽段合成。可实现?-互补，用蓝白斑实验筛选阳性重组子。 二、噬菌体载体（bacterieophage） （一）?噬菌体载体 线状双链DNA分子，两端有COS位点。其特点是1、功能相关的基因排列在一起，中间部分的基因是溶菌生长的非必需区。2、成熟的噬菌体需要经过包装过程，将重组DNA（15~25kb)包装进头部和尾部蛋白中，均可被包装为成熟的病毒颗粒。 ?噬菌体载体 可分为插入型载体（ ?gt10)和置换型载体(EMBL)。 （二）粘粒（cosmid）由? DNA的COS区与质粒重新构建的载体。克隆容量35~50kb。 （三）M13噬菌体载体 。基因组为ssDNA,感染细菌后为dsDNA,分泌到细胞外而不产生溶菌。可用于制备单链DNA探针。 三、原核表达载体（一）大肠杆菌表达载体 概念：用来在原核细胞中表达外源基因的载体。 特点：1、需有启动子（Lac、trp、tac、pL、T7）2、SD(AGGAGGU)序列和ATG。3、MCS.4、选择性标志的编码序列。5、转录终止序列。 分类：融合型蛋白表达载体：N-末端由原核基因编码序列与C-末端真核基因编码序列合在一起，转录和翻译成的蛋白质为融合型蛋白 非融合型蛋白表达载体。非融合型蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白。 （一）、pGEM单链系统 （二）、融合蛋白表达载体pGEX系统 特征：在MCS上游有Ptac控制谷胱甘肽巯基转移酶基因，Ampr，经修饰的 LacI阻遏蛋白基因， Lac操纵基因， Ori。 表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和插入基因表达产物的融合体。 优点：IPTG可诱导，表达产率高，分离纯化简便。 （三）、非融合型蛋白表达载体 pKK223-3 由PBR322构建，含tac强启动子，操纵基因，SD序列，PU