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PCR方法快速检测HBV指导教师:于红张文卿学生:刘晓林王远贺王瑞静一、实验背景知识1、HBV与乙型肝炎【HBV结构】【HBV致病性】HBV传播乙型肝炎的四种传播途径为:1、血液、血制品等医源性传播2、母婴传播3、生活密切接触传播4、性传播HBV与肝硬化、原发性肝癌关密切！【血清HBVDNA检测】血清HBVDNA是HBV感染、复制、血液有传染性的直接标志。实验者综合PCR实验的优缺点，实验条件，选择应用PCR检测HBV。二、实验原理【PCR反应成分】1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等。试剂名称试剂量终浓度10xbuffer3.0μl1xbuffer10xdNTP3.0μl0.2μM25mMMgCl21.8μl1.5mMPrimer10.6μl0.5μMPrimer20.6μl0.5μMDNAtemplate2.0μl1.0ngTaqDNApolymerase0.3μl1.5UPureddH2O18.7μl合计30.0μl三、实验准备【实验材料】：引物：5`—TGACAAGAATCCTCACAATA—3`5`—AGCCCTACGAACCACTGAAC—3`(扩增HBV的S基因，产物长度493bp)PureddH2O10xbuffer10xdNTP25mMMgCl2TaqDNA聚合酶溴酚蓝溴化乙锭TBE缓冲液琼脂糖阳性标本一例待测标本两例阴性标本一例【实验仪器】：PCR扩赠仪水平式电泳槽紫外透射仪凝胶成像分析仪微量加样器等四、实验步骤1、取一支Eppendorf管，按如下顺序和计量，依次加入。PureddH2O112.2ml10xbuffer18ml10xdNTP18ml25mMMgCl210.8mlprimer13.6mlprimer23.6mlTaqDNA聚合酶1.8ml5、依次从五个Eppendorf管中取出扩增后的液体，以5：1的比例与溴酚蓝混合，依次加入凝胶孔中。另一孔中加入Mark6、近凝胶孔侧接“—”极，对侧接“+”极，电压80V,电泳30分钟.7、取出凝胶,在紫外灯下观察结果.
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