细胞培养技术实验细胞培养的无菌操作-大学课件-.pptxVIP

细胞培养的无菌操作;【培养前准备】;【操作野消毒】;【洗手和着装】;【火焰消毒】;【操作】;实验二常用仪器设备的使用;一、实验目的 掌握细胞培养中常用仪器设备的使用和保养方法 二、器材 ¨ 双重纯水蒸馏器 ¨ CO2培养箱 ¨ 压力蒸汽消毒器 ¨ 净化台 ¨ 倒置显微镜;三、操作;（一）CO2培养箱;（一）CO2培养箱;注意：;（二）双重纯水蒸馏器;（三）倒置显微镜;四、注意事项;四、注意事项;五、结果与讨论;实验三细胞培养用品的清洗、包装和消毒;一、实验目的;二、实验原理;三、器材;三、器材;三、器材;三、器材;四、试剂和材料;五、操作;刷洗 将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干或烘干（50℃），备浸酸。 浸酸 浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。浸酸时放取器皿要小心。;4）冲洗 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤 浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复 “注水－倒空”15次以上，最后用三蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干（50℃）后备包装用。;玻璃器皿的包装 包装材料常用牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿、铝箔等。小的培养器皿用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。 玻璃器皿的消毒 玻璃器皿的消毒可以用高温湿热灭菌（20－30min和高温干热消毒（160℃保持90－120分钟）。;（二）橡胶制品的清洗、包装与消毒;（三）塑料制品的清洗、包装与消毒;（四）金属器械的清洗、包装与消毒;（五）正压除菌滤器的清洗、包装与消毒;（六）针头滤器的清洗、包装与消毒;实验四动物细胞培养用液的配制和无菌处理;一、实验目的;二、实验用品;三、操作;配制程序：;配制注意事项：;（二）血清的灭活处理;（三）0.25％胰蛋白酶的配制;（四）RPMI-1640的配制;（四）RPMI-1640的配制;四、注意事项;实验安排;实验安排;实验五鸡胚成纤维细胞的原代培养;一、实验目的;二、实验原理;三、器材;四、试剂和材料;五、操作;3、消化;4、离心和计数 离心（800r/min,10min），弃去上清液，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打混匀后取样计数。根据计数结果用培养液调整细胞浓度为1×106个/mL 。 5、接种培养 每瓶培养瓶接种4mL细胞悬液，再添加6mL培养液，轻轻混匀后，盖紧瓶塞，标上细胞名称，组号和接种日期等，置37℃、5％CO2培养箱 中开放培养（旋松培养瓶盖）。;6、观察;细胞计数;;计数方法;培养液换半量方法：;六、结果与讨论;实验六乳鼠肺细胞的原代培养;一、实验目的;二、实验原理;三、器材;四、试剂和材料;五、操作;5、打开消毒器械包，在胸廓正中线位处，用眼科弯镊夹起乳鼠胸部皮肤（多夹些）,用解剖剪 开适当位点后,用两把眼科弯镊向左右两侧撕拉，皮肤外翻固定，充分暴露躯干部肌肉（注意： 不要使表皮面接触到已暴露出来的胸腹肌）。 酒精消毒乳鼠胸廓后，换一套金属器械，沿着 隔膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断。胸廓 暴露后，可见跳到的心脏和粉红色的肺。换一 把弯头眼科镊，将弯头向下，从心脏右上方插 入心肺连接处，轻轻向上用力，将心肺一齐取 出，放置在灭菌的培养皿中，用镊子去除心脏，肺移入已加Hanks液的青霉素瓶内。;（二）漂洗 用Hanks液清洗肺脏表面血污，然后用眼科直剪粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次，去净血污，将洗净的组织块置青霉素小瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余液体。;（三）剪切 用眼科直剪将洗净的组织块反复剪成0.5-1立方毫米的小块，此过程需20～30分钟 （剪切时为保持组织湿润，可向组织块滴加1～2滴培养液）。然后用吸管滴加几滴培养液，轻轻吹打混匀。;（四）接种和培养 用润湿的吸管分次吸取小碎块悬液，注意吸在吸管前端部，以免吸得过高，使组织小块粘附于管壁而丢失。将组织碎块在培养瓶底部均匀放置（块距0.3cm大小），25毫升培养瓶放20～ 30块为宜。然后轻轻翻转培养瓶，加入适量培养液(液层厚约15mm)盖好，标记好，置37℃ 孵箱中培养4-24小时。待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织块，静置培养。操作过程中动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。;（五）观察 ¨ 静置培养3天后开始在显微镜下观察细胞生长情况。注意观察培养组织小块边缘是否长出新细胞。一般最先出现的是形态不规则的游走细 胞,接着是成纤维细胞或上皮细胞。当细胞分裂，细胞数量增多时，在组织块周围可见到生长晕。随后细胞生长分裂增快，呈放射状向外