SNT 2474-2010大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2474—2010大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法Detection of Phytophthora sojae with real-time PCR2010-01-10 发布2010-07-16实施中华人民共和国发布发13151查询真1国家质量监督检验检疫总局数码防 SN/T 2474-—2010前言请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、南京农业大学、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中国农业大学。本标准主要起草人：章桂明、王源超、吴际云、彭金火、严进、程颖慧、王颖、易建平、崔澍、杨伟东、杨立群、聂文革、缪建锟。本标准为首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2474—2010大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法.1 范围本标准规定了大豆疫霉病菌（Phytophthora sojae Kaufmann &Gerdemann)的实时荧光 PCR检测鉴定方法。本标准适用于大豆夹杂的土壤传带大豆疫霉病菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件；其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法3原理3.1分类学地位学名:Phytophthora sojae Kaufmann &. Gerdemann病害名称：大豆疫霉病菌;常用英文名:Soybean Phytophthora Root Rot分类地位：藻菌界 Chromista，卵菌门Oomycota，腐霉目 Pythiales，腐霉科 Pythiaceae，疫霉属 Phytophthora3.2实时荧光 PCR利用荧光信号伴随着 PCR产物的增加而增强的原理，在 PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，得出大于平均值的荧光值即阈值，收集荧光信号增强到预定阈值时的 PCR 循环次数，即 Ct 值。根据 Ct 值判断样品是否带有大豆疫霉病菌。4　取样方法大豆夹杂土壤的取样按照SN/T1131进行。5仪器和试剂5.1主要仪器5.1.1烘箱。5.1.2高压灭菌锅。5.1.3 摇床。5.1.4水浴锅。5.1.5 纯水仪。5.1.6　高速冷冻离心机。5.1.7实时荧光 PCR仪。5. 1.8 微量移液器(0. 1 μL～2. 5 μL,2 μL～20 μL,20 μL～200 μL,100 μL～1 000 μL)。5.1.9真空抽干仪。 SN/T 2474--20105.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。5.2.1 CTAB 提取液:2%CTAB(质量浓度),100 mmol/L Tris ·C1(pH8.0),20 mmol/L EDTA(pH8.0),1.4 mol/L氯化钠。5.2.2Tris 饱和酚。5.2.3 三氯甲烷。5.2.4 异戊醇。5.2.5异丙醇。5.2.6 无水乙醇。5.2.7RNase.5.2.8PCR 反应试剂:PCR Buffel氯化镁、dNTPs(dATP;dUTP、dCTP、dGTP)、SBYR GREENmix、Taq Man master mix.5.2.9醋酸钠。6 检测与鉴定6.1土壤中卵孢子核酸制备6.1.1将试样研磨,过 120 目筛。置于样品瓶中,密封→并标明标记6.1.2清洗实验器皿，于121℃、30min湿热灭菌或.180℃干热灭菌1h。6.1.3称取5g磨成粉末状的土样，倒人锥形瓶中，加.150ml无菌水|再加10μL～20μL吐温，混匀，260 r/min 摇动 15 min。6.1.4将处理过的土样液倒入200目的筛网过筛，用清水不断冲洗；将下层冲洗液倒入400目的筛网750·目的筛网抽气过筛，最后将筛网上卵孢子收集抽气过筛，用清水不断冲洗；再次将下层冲洗液倒入物倒人研钵，60℃烘干。6.1.5将烘干的卵孢子收集物加液氮进行流分研磨，然后加-4mL预热的CTAB抽提液，部分抽提液用于洗涤研钵。6.1.6将离心管放人水浴锅前先振荡1min，然后放人/65℃水溶锅水溶15 min，每隔3min～5min 振荡一次。6.1.7加三氯甲烷4mL，用移液器混匀1min，