一种新型生物反应器的基因测序分析.docx

? ? 一种新型生物反应器的基因测序分析 ? ? 杜 巍 王 坤 芦旭飞 叶天彤 （北京京环新能环境科技有限公司，北京 100020） 0 引言 垃圾填埋渗沥液通常指填埋过程中及雨水渗漏产生的液体。基因测序是指通过对微生物的遗传基因进行测定来确定环境中微生物的种类和浓度的一种分子生物学分析方法。16S核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）测序是一种特殊的基因测序方式，其中16S指的是细菌RNA的沉降系数，即颗粒在单位离心力场中粒子的移动速度，对大分子物质沉降系数通常在10 s~13 s左右。对细菌的基因组织进行离心沉降后，按照沉降系数可分为3种，即5S、16S和23S。细菌的16S RNA高变区具有明显的细菌种属特征，便于区分不同细菌。因此对细菌16S RNA高变区的扩增产物进行高通量测序，再将所得结果与数据库比较，可以得到样品中细菌的菌群结构和多样性及分布特征。 胡小松等对复齿鼯鼠干燥粪便样品中微生物16S RNA基因进行测序，发现厚壁菌门（87.68%±2.68%）、拟杆菌门（7.62%±3.74%）为优势菌门。李俊峰基于16S RNA分析流程找出了在胃炎病人和健康人中丰度显著差异的物种。郝兵兵从膜生物反应器（membrane bio-reactor，MBR）反应器中分离纯化、筛选出一株假单胞菌，该菌株对水产养殖废水中的硝酸盐有较好去除效果。 1 材料与方法 1.1 测试方法与流程说明 1.2 样品分组与多样性分析方法 该研究将对接种菌种样品、实际生物反应器样品、曝气池样品3类样品进行16S RNA基因测序，得到样品信息库，最终根据结果进行多样性分析。 对所测样品根据其来源分为A、B、C共3组，其中A组为接种菌种样品组，B组为实际生物反应器样品组，C组为曝气池样品组。菌种原样标记为ACJ1；生物反应器段标记为BZP1、BZP2；曝气池段标记为CBQ1、CBQ2、CBQ3和CBQ4，具体的取样分组信息见表1。 表1 16S RNA测序分组情况表 这里采取组间进行A组与B组BZP1、A组与C组CBQ2、A组与C组CBQ4共3次对比。这一过程将依次采取赵式（the chao1 index，Chao1）菌群丰富度指数曲线、香农-威纳（shannon-wiener，Shannon）多样性指数曲线、辛普森（ginisimpson，simpson）多样性指数曲线以及准确覆盖率（Good′s 该研究是针对北京某填埋场的生物反应器渗沥液处理设施而进行的。该处理设施采用生物反应器+曝气池+膜处理工艺对填埋场渗沥液进行处理，其中生物反应器+曝气池为前端生化处理部分，具体流程图详如图1所示。该研究旨在通过16S RNA基因测序研究能够适应垃圾渗沥液这种高盐高氨氮环境的微生物的种群分布及主要功能菌。coverage）测序深度曲线对OTU数据测定结果进行全面和准确性检验，确保后续利用OTU数据得到正确的分析结论。 图1 生物反应器-膜处理工艺流程示意图 chao1指数稀释曲线指的是用chao1算法估计群落中含OTU数目的指数，是一种生态学中常用的估计物种总数的方法，如公式（1）所示。 式中：1是估计的OTU数；是实际观察的OTU数；是只有1条序列的OTU数目；是只有2条序列的OTU数目。 shannon-wiener指数稀释曲线，反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。 计算指数如公式（2）所示。 式中：为-指数。各种之间，个体分配越均匀，值就越大；为个体序号。为样品中属于第种的个体的比例，如样品总个体数为，第种个体数为，则=/。 Simpson指数稀释曲线在生态学中常常用来定量描述一个区域的生物多样性。当样品中只有1个物种时（即所有序列都代表同一个物种），值为0；当样品中各物种均匀分布时，值为1。Simpson指数值越大，越均匀，群落多样性越高。Simpson指数计算公式如公式（3）所示。 式中：为Simpson指数；n为样品中含条序列的OTU 数；为样品总序列数。 Good′s coverage指数稀释曲线用于评估测序结果代表的菌种群落中物种的总数，常用于评估测序深度是否足够。其计算公式如公式（4）所示。 式中：为Good's coverage指数；为样本中OTUs的数量；为OTUs总丰度。 2 组间对比分析 2.1 ACJ1与 BZP1对比分析 ACJ1与BZP1这2组数据的多样性对比见表2。从表2中可以明显看出，ACJ1与BZP1从多种测试方法角度来看均存在较大差异。实际操作过程中，ACJ1为培养初期所使用的菌种，BZP1为经过长时间驯化后实际生物反应器工艺段中存在的菌种。显然，实际过程中菌种组成已发生了较大改变，因此后续将