UPLC‑MS-MS分析及NMR技术鉴定千金子中二萜类化合物△.docx

? ? UPLCMS/MS分析及NMR技术鉴定千金子中二萜类化合物△ ? ? 孙明娜，吴孟华，陈虎彪，林敏婷，刘韵，张玲玲，张建业* 1.广州医科大学 药学院/附属第五医院 广东省分子靶标与临床药理学重点实验室，广东 广州 511436；2.暨南大学 药学院，广东 广州 510632；3.香港浸会大学 中医药学院，香港特别行政区 中药及天然产物在药物开发和应用中占有举足轻重的地位，是先导化合物的重要来源之一[1]。全球批准上市的抗癌药物中73%非合成所得，其中47%是天然产物或其衍生物[24]。传统中药千金子是大戟科植物续随子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟种子，用于二便不通、水肿、痰饮、积滞胀满、血瘀经闭[5]。其化学成分主要有脂肪油、蛋白质、甾醇、二萜酯及游离二萜醇、香豆素等。现已发现的多种二萜类化合物千金子素（euphorbia factor，EF）L1～L25等，其中EFL1、EFL2、EFL3含量最高约占0.2%～0.4%。现代药理学及临床研究表明，千金子中的二萜类成分具有一定的抗肿瘤活性[67]。 本课题组前期进行了千金子中二萜类成分的提取分离，发现EFL1、EFL2 和EFL3 具有明显的抗肿瘤作用。最初，发现EFL1 对人口腔表皮样癌细胞KB、口腔表皮样癌耐药细胞KBv200、人乳腺癌细胞MCF7 及人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF7/ADR 等肿瘤细胞具有显著的增殖抑制作用[8]；随后发现EFL1 具有逆转ATP 结合盒蛋白亚家族B 成员1（ATPbinding cassette subfamily B member 1，ABCB1）介导的KBv200 及MCF7/ADR 细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的活性，但并不影响该细胞对化学治疗药的敏感性[9]；此外，EFL1 可降低抗癌药对ABCB1高表达的人白血病阿霉素耐药细胞K562/ADR 的半数抑制浓度（IC50），并可通过线粒体途径增敏细胞K562/ADR 的凋亡[10]；再者，EFL1 也可增加活性氧的释放、降低线粒体膜电位、释放细胞色素C（cytochrome C，Cyt C），从而诱导人肺癌细胞A549的凋亡[11]。本课题组也发现，EFL2和EFL3 对肺癌A549 细胞有显著的抑制作用，其作用机制与通过线粒体途径诱导凋亡相关[1213]。为了进一步探讨千金子中的药效物质基础，本研究采用超高效液相色谱质谱法（UPLCMS/MS）分析与传统的乙醇回流提取及色谱分离相结合的方法研究千金子乙酸乙酯提取部分的化学成分，并利用分离所得化合物的核磁共振（NMR）数据验证UPLCMS/MS的分析结果。 1 材料 1.1 试剂 分析纯有机溶剂如乙醇、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、环己烷、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚均购自广州佳钻生物科技有限公司；色谱纯试剂如甲醇、乙腈购自广州威佳科技有限公司；柱色谱硅胶（200～300 目，青岛海洋化工有限公司）；Sephadex LH20 型葡聚糖凝胶（瑞士Pharmacia Biotech 公司）；千金子购自河北安国药材市场，经香港浸会大学陈虎彪教授鉴定为大戟科续随子EuphorbialathyrisL.的干燥成熟种子，标本保存于广州医科大学药学院植物标本室；对照品EFL1、EFL2、EFL3为自制样品，纯度均大于99%。 1.2 仪器 1290 型超高效液相测谱仪、G6540A 型飞行时间质谱仪（Agilent Technologies 公司）；质谱分析软件为Agilent MassHunter（G333660048）；工作站软件为Qualitative Analysis B.06.00；Inova500 NB 型核磁共振仪、Inova400 NB 型核磁共振仪（美国Varian公司）。 2 方法 2.1 提取分离 取千金子药粉16 kg，用95%乙醇（4 L·kg-1）加热回流，提取3 次，每次3 h。合并提取液后减压浓缩得浸膏。将浸膏混悬于蒸馏水中，依次用环己烷（4 L）和乙酸乙酯（4 L）提取（各3 次）。乙酸乙酯层减压浓缩后，进行硅胶柱色谱（石油醚乙酸乙酯洗脱）和Sephadex LH20 柱色谱（二氯甲烷甲醇洗脱）分离。 2.2 样品制备 分别称取EFL1、EFL2、EFL3、千金子乙酸乙酯提取部分0.1 mg，溶解于10 μL三氯甲烷中，再用色谱甲醇稀释至1 mL，得对照品溶液和供试品溶液。 2.3 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；ACQUITY Van Guard BEH C18色谱柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；检测波长分别为210、230、250