分枝杆菌原生质体诱变产9—羟基—雄烯二酮菌种选育-《江苏农业科学》(2017年23期).docx

龙源版权所有 分枝杆菌原生质体诱变产9—羟基—雄烯二酮菌种选育作者：薛凯 王荣 王友富 李良智 胡翠英 扶教龙来源：《江苏农业科学》2017年第23期 摘要：为获得转化底物植物甾醇为9-羟基-雄烯二酮（简称9-OH-AD）的高产稳定菌株，将出发菌株分枝杆菌制备成原生质体，并对其原生质体进行定向紫外诱变筛选。结果表明，NaCl为最佳的分枝杆菌原生质体渗透稳定剂，最适浓度为0.5 mol/L，在此条件下获得的原生质体数量为3.1×108个/mL，且最终获得1株比出发菌株9-OH-AD生产量提高84.7%的菌株MS23，经传代3次，9-OH-AD的积累量分别为37.32、41.64、38.77 mg/L，具有良好的遗传稳定性。产品通过液相色谱进行确证，同时在5 L发酵罐中进行转化制备9-OH-AD的初步研究。经原生质体紫外诱变获得的遗传性稳定的9-OH-AD高产菌株可用于进一步的转化制备条件优化研究。 关键词：分枝杆菌；原生质体诱变；9-OH-AD；菌种选育；液相色谱 中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0288-04 收稿日期：2016-09-16 国内外以甾醇为原料、利用分枝杆菌等微生物转化生产9-OH-AD已成為研究热点。例如Shtratnikova等已测出能够转化植物甾醇为9-OH-AD的分枝杆菌VKM Ac-1817D的完整基因序列[4]；姚抗深入研究了微生物降解甾醇中与 9-OH-AD的合成和降解相关的2个关键酶（3-甾酮-9α-羟基化酶与3-甾酮-Δ1-脱氢酶）[5]；袁家代等通过构建kshA和kshB基因共表达的重组菌对3-甾酮-9α-羟基化酶编码基因进行异源表达，成功对分枝杆菌生物转化特性进行了改造，制备获得了9-OH-AD[6]；范书玥等从土壤中筛选出具备甾醇降解能力的分枝杆菌（Mycobacterium sp. NwIB-01），对该菌的3-甾酮-9α-羟基化酶进行了基因克隆、异源表达与分离纯化，为进一步利用基因工程手段改造分枝杆菌菌株，提高其转化甾醇的能力从而为利用基因工程菌进行工业化生产9-OH-AD等奠定了基础[7-8]。此外，Sukhodolskaya等研究表明，主产9-OH-AD的同时由于残余的3-甾酮-Δ1-脱氢酶的存在，也会有部分的降解发生[9]。因此，田琳等通过同源重组用体外突变失活的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因代替分枝杆菌染色体上正常的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，导致整个3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因失活，以让3-甾酮-Δ1-脱氢酶无法表达，从而使9-OH-AD得以积累[10]。另一方面，9-OH-AD的生产存在甾醇水溶性差、传质效率低、底物毒害、产物抑制以及产物降解等问题，许多研究者也做了大量相关的研究[11-14]。总体而言，国内外尚无生物法制备9-OH-AD的工业生产，筛选并获得制备9-OH-AD的高效菌株具有重要的工业意义。 为此，本研究对实验室已有的分枝杆菌进行原生质体紫外诱变系统研究，确定分枝杆菌原生质体的制备条件，并比较筛选得到的菌株制备生产9-OH-AD的能力，获得1株生产转化能力较好的菌株，最后用该菌株在5-L生物反应器中进行转化制备9-OH-AD的初步研究。 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1试验菌株出发菌株分枝杆菌（Mycobacterium sp.）于笔者所在实验室4 ℃冰箱中斜面保藏。 1.1.2试剂植物甾醇，由浙江省神洲药业有限公司提供；玉米浆，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溶菌酶，购自国药集团化学试剂有限公司；酵母粉为生化试剂；甘油、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、NaNO3、（NH4）2HPO4、无水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。 预处理液：0.8% EDTA、0.1%巯基乙醇，用pH值为6.0的磷酸缓冲液配制。 原生质体渗透稳定剂：0.5 mol/L蔗糖、10.0 mmol/L MgCl2，用pH值为6.0的磷酸缓冲液溶解。 分枝杆菌去壁酶液：含质量分数为1%的溶菌酶的原生质体渗透稳定剂，微孔滤膜过滤除菌。 1.1.3仪器SPX-250BSH-II生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；BIOTECH-5JG-7000A 5 L发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司）；PHS-3TC pH电极（上海天达仪器有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器灭菌锅（上海博迅实业有限公司）；TS2102摇床（上海天呈实验仪器制造有限公司）；SW-CJ-2FD超净工作台（上海博迅实业有限公司）；SA224S电子天平[赛多利