基于高通量测序的野生毛葡萄转录组SSR信息分析-《江苏农业科学》(2017年20期).docx

龙源版权所有 基于高通量测序的野生毛葡萄转录组SSR信息分析作者：方辉 蒋胜理 曲俊杰 周思泓 潘凤英来源：《江苏农业科学》2017年第20期 摘要：利用毛葡萄叶片高通量转录组测序数据进行简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）搜索并对其所在的序列进行注释，从而为毛葡萄分子标记开发提供有效信息。从35 238条质量较高的unigene中搜索到4 428个SSR位点，对这些序列进行基因本体（gene ontology，简称GO）、同源蛋白质簇（cluster of orthologous groups of proteins，简称COGs）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyslopedia of genes and genomes，简称KEGG）分类，给出功能注释和Pathway注释，共注释了3 197条unigene。COG数据库将SSR序列分成25类，通过GO分类和KEGG富集性分析，将SSR序列分别归类于38个GO类别和103条通路。这些序列涉及了许多重要的生物功能和代谢途径，预示着这些潜在的标记可能与重要的生物功能有关，这些信息为毛葡萄分子标记的开发和应用奠定了基础。 关键词：毛葡萄；转录组；高通量测序；简单重复序列（SSR） 中图分类号： S663.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0064-04 野生毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd）是葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis）真葡萄亚属（Euvitis）东亚种群的一个种，产于中国，是我国葡萄属东亚种群中分布最广的一个野生种，主要集中分布在广西的桂中、桂北、桂西的喀斯特地貌地区[1]。野生毛葡萄含有各种氨基酸、矿物质、多种维生素，还含有丰富的超氧化物歧化酶、白藜芦醇和花色素双糖苷，具有抗衰老、防癌、软化血管的作用[2]。大部分野生毛葡萄表现出抗逆性强、耐旱耐瘠、耐病性好、耐高温潮湿天气等优良特性，是南方“石漠化治理、生态重建”的优良树种，具有重要的经济价值[3]。 简单重复序列（simple sequence repeat，简称SSR）又名微卫星（microsatellites），是基因组中以少数几个核苷酸（一般为2～6个）为重复单元串联重复组成的长度为几十个碱基的核苷酸序列，其中最常见的是双核苷酸重复[4]。SSR标记广泛分布于各种生物基因组上，因其重复单元不同和重复数的差异，构成了SSR序列的多态性。SSR标记具有多态性丰富、保守性高、共显性遗传的特点，成为当前应用较广泛的分子标记之一。以往的SSR标记开发方法一般利用基因组文库杂交测序，花费时间长且效率低，不适于短时间内开发大量的标记用于遗传学应用研究。随着高通量测序技术的快速发展，即使一次性对上百万条DNA分子进行序列测定也不再是问题。目前SSR标记在葡萄遗传多样性、遗传图谱、品种鉴定和亲缘关系等方面已经得到了广泛的应用。 目前，国内外对于高通量测序后检测获得的大量SSR序列，主要分析SSR重复基元分布特征和重复序列组成规律，对SSR序列进行功能注释和功能分类的研究较少。此外，对葡萄进行种质资源和亲缘关系分析是利用已知或通用的SSR，没有进一步筛选和扩展SSR分子标记[5-6]。本研究数据来源于毛葡萄叶片的转录组数据，转录组SSR源自基因组编码可表达的序列，直接与功能基因相关，保守程度更高，转移概率较大。研究含有SSR的转录组序列信息，有利于获得SSR序列相关功能注释信息，从而获得更有针对性的SSR分子标记，以便更有效地为基因定位、遗传多样性研究及分子育种提供有效手段。 1 材料与方法 1.1 材料 植物材料为毛葡萄五峒-1，生长于广西壮族自治区河池市都安瑶族自治县高岭镇五峒村，树龄10年，生长旺盛，叶片生长状況良好，果实产量高，经调查与试验发现其对多种病害高抗或免疫。采集样品后用液氮速冻，并转移至-80 ℃保存备用。 1.2 方法 1.2.1 野生毛葡萄测序 采取野生毛葡萄的嫩叶并提取总RNA，送到北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行文库构建和RNA高通量测序，测序平台为Illumina HiSeqTM 2000，每个样品的测序量约为4.75Gb。 1.2.2 测序数据的组装 对测序后得到的原始数据进行质量分析，去除重复、含接头、测序质量低的reads，获得clean reads。使用短序列组装软件Trinity[7]进行转录组从头组装，首先将含有一定长度区域重叠的reads连成更长的片段，然后通过reads重叠关系得到组装片段的contig，再将reads比对回contig，再通过paired-end reads来确定来自同一转录本的不同contig以及这些cont