内蒙古锡林郭勒草原主要野生蘑菇分子进化及其系统发生学 -《江苏农业科学》(2020年9期).docx

龙源版权所有 内蒙古锡林郭勒草原主要野生蘑菇分子进化及其系统发生学 作者：李亚娇 孙国琴 郭九峰来源：《江苏农业科学》2020年第09期 关键词：草原蘑菇;ITS序列;分子系统发生学;系统进化树;分化时间 系统发生（phylogeny）也称系统发育、系统演化，是某一个类群的形成和发展过程，也就是进化或演化关系[1-2]。草原蘑菇主要生长在我国内蒙古中部草原地区，在草原上形成蘑菇圈，维持牧草与草原蘑菇共生的生态体系[3]。目前对草原蘑菇分类的研究一直处于形态学分类研究阶段，运用分子标记对其属内种类进行系统发生分析的研究还是比较滞后的。国内外有大量关于运用系统发生学研究食用菌分类的报道[4-6]。武冬梅运用分子系统发生学探究新疆野生羊肚菌在物种水平上表现出较高的遗传多样性[7]。刘晓亮等通过分子系统发育学对东北大小兴安岭地区的红菇属进行物种多样性分析，共鉴定出23个红菇属物种，其中有3个种此前从未在我国报道过，分别是果香红菇、暗红红菇和诺尔亚红菇[8]。目前，利用草原蘑菇内转录间隔区（ITS）序列进行系统发生学探究还未见报道，本研究通过18S和ITS 2组通用引物扩增草原蘑菇基因组DNA片段，产物直接测序，结合BLAST、MEGA 6.0等生物信息学软件进行序列比对、遗传参数计算，以及构建系统进化树、分子钟等[9-11]，以期为草原蘑菇的鉴定、进化分类及遗传育种方面的深入研究提供数据参考。 核糖体DNA（rDNA）中既包含保守的编码区18S、5.8S和28S，适合种以下水平的研究[12-13]，又包含进化速率较快的非编码区，内转录间隔区1内转录间隔区和2（ITS1和ITS2）以及非转录区，承受的进化选择压力较小，进化速度较快，适合属以下水平的研究[14-15]。因此，常选用18S和ITS通用引物作分子标记研究不同分类地位的物种间关系[16]。这在食用菌分子鉴定及系统发育中已有大量应用[17]，钱雪婷等基于ITS序列分析秦巴山区黑木耳菌株的遗传多样性，为今后秦巴山区黑木耳菌株的遗传多样性及优良品种的遗传育种奠定了理论基础[18]。戴淑娟等对采自新加坡的多孔菌基于ITS序列的系统发育分析结果表明，该新种属于变色卧孔菌属分支的一个明确的支系[19]。刘丽娜等利用ITS序列分析一个子实体菌盖为酒粉红色的金针菇新变型，结果表明，该变型同一子实体具有5种不同的ITS序列，表明金针菇存在丰富的种内遗传多样性[20]。本研究采用18S和ITS 2组通用引物扩增产物直接测序，对测序结果进行比对，2组测序结果互相印证补充，可使结果更加可靠。 草原蘑菇是内蒙古锡林郭勒草原产出的上品山珍，具有较高的营养价值和药用价值，是珍稀的食药用菌[21-22]。草原蘑菇主要品种有白蘑、黑蘑、香杏蘑、鸡爪蘑、珍珠蘑等，被誉为“草原明珠”“口蘑之王”等[23]。草原蘑菇以草-牧-菌循环的独特生长方式维系着大草原的生态平衡。近年来，草原气候干旱、退化日益严重，载畜量增加，加之人们过度采食，使这一珍贵的野生草原蘑菇自然生存条件愈加恶化，甚至濒临灭绝，其资源保育、驯化及利用研究任务艰巨，而且目前市场上的草原蘑菇种类混乱，以次充好、胡乱命名等现象时有发生，令人真伪难辨[24]。本研究从本质上对内蒙古中部草原地区草原蘑菇品系进行鉴定，通过形态学与分子标记相结合，研究各菌株之间的亲缘关系和分化时间，以期为后续草原蘑菇的种质资源创新和利用、草原蘑菇品种选育和遗传改良提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试材料 草原白蘑和草原黑蘑采自内蒙古锡林郭勒盟白音锡勒草原地区，草原白蘑编号为草原白蘑74～89号，包含蒙古口蘑、花脸香蘑、青腿子等;草原黑蘑编号为蒙白音1～73号，其中，1～37号为白色鳞片，38～73号为棕色鳞片。 1.2 DNA提取 1.2.1 子实体DNA提取 将供试子实体置于 65 ℃ 烘箱内8 h烘干，然后置于微量植物样品粉碎机内粉碎，分装于离心管内，做好标记以备DNA提取。称取适量子实体粉末用天根试剂盒提取DNA[25]。 1.2.2 菌丝体DNA提取 提取适量菌丝体，置于液氮中研磨后用天根试剂盒提取DNA。 1.3 PCR扩增 18S序列通用引物（18S上和18S下）碱基序列为18S上：GTAGTCATATGCTTGTCTC;18S下：TCCGCAGGTTCACCTACGGA。 ITS序列通用引物（ITS1和ITS4）碱基序列为ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。 PCR扩增采用20 μL反应体系，包括Mix 10 μL，引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性40 s，45 ℃退火1 min，72